Живое изображение гибели макрофагов клеток во время микобактериальной инфекции у эмбрионов данио-рерио.

Аннотация

Источник: Niu, L. и др. Визуализация гибели макрофагов литических клеток во время микобактериальной инфекции в эмбрионах данио-рерио, с помощью интравитальной микроскопии. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется использование интравитальной конфокальной микроскопии для визуализации гибели макрофагов литических клеток в эмбрионах данио-рерио, последовавшей за инфекцией Mycobacterium marinum .

Протокол

1. Живое изображение инфекции

1. 1. Крепление рыб для живой съёмки
   1. Переместите до 10 эмбрионов, анестезированных трикаином, в середину стеклянной чашки диаметром 35 мм. Сбросьте лишнюю среднюю E3.
   2. Покройте блюдо агарозой с низкой температурой плавления 1% и аккуратно ориентируйте эмбрионы данио-рерио, используя иглу на 10 G. Инкубируйте стеклянную чашу на льде в течение 10 секунд, чтобы агароза затвердела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для инъекции в средний мозг эмбрионы должны устанавливаться в агарозу с головой, направленной вверх (рисунок 1A).
   3. Когда всё полностью затвердеет, накройте агарозу слоем яичной воды (плюс 1 x трикаин и PTU (N-фенилтиовера)).
2. Трёхцветная высококачественная конфокальная микроскопия с таймлапсом
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы проводятся на конфокальной микроскопии, оснащённой масляной УФ-объективом 63,0x 1,40.
   1. Установите температуру в камере окружающей среды на 28,5 °C. Вложите в камеру влажную папиросную бумагу, чтобы обеспечить влажность и предотвратить испарение яичной воды.
   2. Поместите стеклянную чашу с дном 35 мм вместе с данио-рерио в камеру окружающей среды.
   3. Откройте программное обеспечение Confocal и инициируйте этап. Переключитесь на масляный УФ-объектив 63,0 x 1,40 и определите данио-рерио с помощью яркого поля с фильтром дифференциального интерференционного контраста (DIC).
   4. Откройте лазер 405 Diode, Argon (20% мощности) и DPSS 561 нм. Настройте соответствующие настройки мощности и спектра лазера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены настройки спектра для Церулеан (возбуждение = 405 нм; излучение = ~456–499 нм), eGFP (возбуждение = 488 нм; излучение = ~500–550 нм), DsRed2 (возбуждение = 561 нм; излучение = ~575–645 нм)
   5. Выберите режим получения «XYZ» «Последовательное сканирование» и установите формат изображения на «512 x 512 пикселей».
   6. Переключитесь в режим «Live Data Mode». Прицеливайтесь в позицию первой данио-рерио и отметьте позиции «Начало» и «Конец» Z. Повторяйте этот процесс для каждого из оставшихся эмбрионов. В конце программы можно добавить «Пауза».
   7. Определите цикл и цикл программы.
   8. Сохраните файл.

Результаты

Рисунок 1: Монтаж эмбрионов данио-рерио для живой визуализации. (A) При инфекции среднего мозга эмбрионы данио-рерио-рерио-рерио, устанавливали с головой, направленной вниз. (B) Для инфекции в области...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стеклянная антенна диаметром 35 мм	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
Агарозе	Sangon Biotech	A60015
Конфокальный микроскоп	Leica	TCS SP5 II
Окружающая камера	Пекон	Регулятор температуры 37-2 цифровой
Mycobacterium marinum			ATCC BAA-535
N-фенилтиочевина (ПТУ)	Sigma	P7629