Оценка бактериального уничтожения в in vitro фагоцитами селезёнки новорождённых мышей

Аннотация

Источник: Семан, Б. Г., et.al. Неонатальная модель визуализации грамотрицательного бактериального сепсиса. J. Vis. Exp . (2020)

В этом видео демонстрируется выделение нейтрофилов и воспалительных моноцитов из селезёнки новорождённых мышей и их применение в люминесцентном бактериальном тесте на уничтожение. Он охватывает механическую диссоциацию, лизис эритроцитов, обогащение клеток на основе магнитных шариков, бактериальную инкубацию и защиту от антибиотиков. Временные показатели люминесценции указывают на первоначальную интернализацию бактерий, за которой следует иммунно-опосредованный клиренс.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этическому обзору животных.

1. Бактериальный анализ на уничтожение бактерий in vitro

1. Удалите селезёнку у неинфицированного новорождённого щенка и поместите её в нейлоновую корзину размером 40 мкм в стерильную чашку Петри диаметром 60 мм. Повторите это, и селезёнки собирают в одну трубку, чтобы собрать и вместе униформировать.
2. Добавьте 5 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), дополненного 10% сывороткой для плода (FBS).
3. Дегрегировать ткань с помощью стерильного поршня для шприца объемом 3 мл до создания суспензии из одной клетки.
4. Соберите суспензию с одной ячейкой снаружи из нейлоновой корзины, перенесите в центрифугную трубку на 15 мл и пеллетные ячейки при 350 х г в течение 5 минут.
5. Подвесьте клетки в буфере лизиса эритроцитов (2 мл на до 7-8 селезёнок) и дайте постоять 5 минут при комнатной температуре, чтобы удалить эритроциты.
6. Промывайте спленоциты с помощью PBS и гранул, как указано выше.
7. Суспендировать спленоциты в 0,25 мл PBS с добавлением 0,5% BSA и 2 mM EDTA в соответствии с ожидаемым выходом клеток.
8. Подсчитайте спленоциты с помощью гемоцитометра или другого подходящего применения.
9. Изолировать клетки Ly6B.2⁺ (миелоидная популяция гранулоцитов/воспалительных моноцитов) с помощью иммуномагнитных шариков.
10. ^{Посеять клетки} Ly6B.2+ с плотностью 1 x 10⁵ клеток на колодцу в чёрную или белую пластину на 96 лунок в объёме 0,1 мл DMEM, содержащего 10% FBS, 2 мМ глутамин и 25 мМ HEPES (полная среда).
11. Перечислите биолюминесцентную кишечную палочку и подготовьте бактериальный инокулум при желаемом множествении инфекции (MOI) в итоговом объёме 0,1 мл. Лучше всего делать всё необходимое для всех скважин в одной партии MOI.
12. Добавьте 0,1 мл бактериального инокулума или полной среды отдельно в качестве контроля. Инкубировать много-колодцевую пластину при 37 °C и 5%_CO2 в течение 1 часа.
13. Замените среду на 0,2 мл свежего полного материала, содержащего гентамицин (100 мкг/мл), аккуратно удаляя среду пипеткой и добавляя свежий носитель новым наконечником пипетки. Верните культуру в инкубацию ещё на 2 часа.
14. Через 3 часа после заражения измеряйте светящееся освещение в каждой яме закрытой крышки с помощью считывателя, а затем возвращайте культуру в инкубацию.
15. Повторять измерения люминесценции в других нужных точках времени.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ACK Lysis Buffer	Gibco	LSA1049201	Анализ бактериального клиренса
Микрошарики анти-Ly-6B.2	Miltenyi Biotec	130-100-781	Изоляция клеток
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (экспрессирует люциферазу)	Н/Д	Н/Д	Построен внутри WVU
Изоляционный буфер	Miltenyi Biotec	Н/Д	Анализ бактериального клиренса
ЛБ Броут, Леннокс	Биореагенты Fisher	BP1427-500	Рост бактерий
EASYstrainer (Нейлоновая корзина)	Bio-one Грейнера	542 040	Ячейное сито
SpectraMax iD3	Молекулярные устройства	Н/Д	Считыватель пластин