Моделирование инфекции у неонатальных мышей с использованием инкапсулированных биолюминесцентных бактерий

Аннотация

Источник: Seman, B. G. и др. Неонатальная модель визуализации грамотрицательного бактериального сепсиса. J. Vis. Exp . (2020)

В видео демонстрируется неонатальная мышиная модель для изучения системных инфекций с использованием инкапсулированных биолюминесцентных бактерий. Новорожденным детям вводят высоко- или низкие бактериальные суспензии и возвращают матери для послеродового ухода. Инкапсулированные бактерии избегают раннего иммунного обнаружения, распространяются системно и визуализируются со временем с помощью люминесцентной визуализации. Эта модель позволяет неинвазивно отслеживать прогрессирование инфекции у неонатальных мышей.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка бактериального инокуля

1. Поставьте триптическую пластину соевого агар (TSA) с инокуляционной петлей для выделения одной колонии из морозильного запаса Escherichia coli O1:K1:H7-lux , которая стабильно экспрессирует люциферазу и обладает устойчивостью к канамицину. Инкубировать ночь при 37 °C.
2. На следующий день дайте бульону Лурия (LB) достичь комнатной температуры (25 °C) в шкафу для биобезопасности.
3. Под капюшоном биобезопасности выделите одну колонию из полосатой пластины и инокулируйте её 3 мл LB с добавлением канамицина (30 мкг/мл). Инкубировать ночь при 37 °C при встряхивании при 220 оборотах в минуту (rpm). Это культура стартов.
4. Разбавьте стартерную культуру 1:100 до свежих 3 мл LB под вытяжкой биобезопасной шкафы и верните в инкубатор на 2-3 часа при 37 °C с встряхиванием (220 об/мин). Это стоковая культура.
5. Считывайте оптическую плотность (OD) как заготовки, так и стоковой культуры на 600 нм с помощью спектрофотометра. Добавьте 100 мкл LB (не содержащего бактерий) в одну скважину плоскодонной анализной пластины на 96 лунок; Это пустота. Затем добавьте 100 мкл из культуры запаса в отдельный колодец. Повторяйте ещё два повторения. Поглощение считывается с помощью считывателя пластин.
6. Вычтите пустое поглощение от значения поглощения стоковой культуры (значение OD) и сравните с ранее сгенерированной и проверенной кривой роста, чтобы определить приближение плотности бактерий в булевой культуре для приготовления инфекционной дозы.
7. Генерируйте целевую вакцину в зависимости от исследовательского вопроса. Для этого исследования использовались целевые инокулуми размером 2 x 10⁶ (низкий) и 7 x 10⁶ (высокие) колониообразующие единицы (CFU) на мышь (/мышь).
   1. Разделите целевую дозу на мышь (DoseT) на предполагаемую концентрацию бактерий в культуре запаса (Stock), чтобы получить объём необходимых бактерий из стандартной трубки (VS).
   2. Умножьте VS на количество мышей (NM), которых необходимо заразить, а также на количество дополнительных мышей на 5-10 дополнительных — общее количество бактерий, необходимое для инфекции, плюс 5-10 дополнительных доз. Удалите этот объём из штатной трубки и добавьте его в новую центрифугную трубку.
   3. Используйте уравнение ниже: DoseT/Stock = VS x NM = общий объём (VT) бактерий, которые нужно удалить из стандартной трубки.
8. Центрифугуйте бактерии при 2000 x g в течение 5 минут при 4 °C и ресуспендуйте бактериальную гранулу в 50 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) (pH 7,2-7,6) на мышь для заражения (например, при 10 дозах по 2 x 10⁶ бактерии на каждую дозу гранулу 2 x 10⁷ бактерий ресуспендируют в 500 мкл PBS). Опять же, рекомендуется готовить больше инокулюма, чем необходимо. Подготовьте равный объём PBS только для контрольных инокуляций. Поддерживайте контроль инфекционного инокулума и PBS на льду до заражения.
9. Проведите семь десятикратных последовательных разбавлений в PBS в пластиковой нижней пластине на 96 лунок и переложите 25 мкл разбавления в дублировании на квадрантные пластины TSA с добавлением канамицина (30 мкг/мл) для перечисления фактического количества введённых бактерий. Инкубировать при 37 °C ночью для формирования колонии перед переписью.

2. Идентификация животных

1. Организуйте достаточное количество пар для размножения так, чтобы помёты могли быть синхронизированы для детёнышей по возрасту. Возрастная вариабельность ± 1 день приемлема.
2. Определите беременную самку мыши C57BL/6 и заранее следите за рождением помёта для точного определения возраста.
3. Чтобы отличить контрольных от заражённых щенков возрастом 3 или 4 дня, используйте пару маленьких ножниц с тонким кончиком радужки, чтобы обрезать только концы хвостов контрольных щенков. Заражённые детёныши не получают обрезки хвоста. Перед отрезкой хвоста продезинфицируйте кожу ватным шариком, пролитым 70% этанола. При необходимости приложите давление на конец хвоста ватной тампочкой или марлей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура проводится под крышкой шкафа для биобезопасности. Достаточно срезать хвост примерно 1/8 дюйма.
4. Для идентификации детёнышей в контрольной и инфицированной группах используйте инсулиновый шприц объёмом 1 мл с постоянной иглой 28 G x 1/2'' для татуировки хвостов малышей. Перед татуировкой продезинфицируйте кожу ватным шариком, смазанным 70% этанолом. Эта процедура проводится под крышкой шкафа для биобезопасности.
5. Чтобы сделать татуировку хвоста, нанесите на кончик иглы чернила для татуировки животных. Затем аккуратно удержите щенка одной рукой, полностью обнажив хвост. Аккуратно вводите иглу под кожу, сохраняя поверхностную глубину, и двигайте иглу параллельно коже на несколько миллиметров, пока не появится небольшая отметка или точка. Подождите несколько секунд, прежде чем медленно снимать иглу из-под кожи, чтобы из-под кожи не выделялись лишние чернила.
6. При необходимости прижимайте рану ватным тампоном или марлей. Удалите излишки татуировочных чернил с поверхности кожи с помощью 70% этанола.
7. Повторите этот процесс с последующих мышами в заражённой и контрольной группах, добавляя дополнительную точку к каждому последующему щенку, нататуированному (например, у щенка 1 будет одна точка на хвосте, у щенка 2 — две точки на хвосте и т.д.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для дополнительного уровня идентификации рекомендуется использовать отдельные цвета татуировочных чернил для животных для контрольной и инфицированной группы.

3. Подлопатечная инокуляция

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования было проведено 2 эксперимента с группой с низкой и высокой дозой, выделенной для каждого эксперимента. В первом эксперименте 7 щенкам ввели низкодозовый прививок (4 малыша использовались в качестве контрольных групп), а 5 щенкам из отдельного помёта — высокую дозу (3 щенка использовались в качестве контрольных групп). Щенки из эксперимента 1 предоставили данные только для 24-часовой точки. Во втором эксперименте 8 щенкам получили инокуляцию с низкой дозой (2 щенка использовались в качестве контрольных групп), а 6 — высокодозовый прививок (2 малыша использовались в качестве контрольных групп). Щенки из эксперимента 2 предоставили данные для 0, 10 и 24-часовых временных точек.

1. Соответствуют возрасту щенков ≤ 1 день. Назначьте каждому помёту либо низкодозированный, либо высокий наполнитель. Внутри помёта случайным образом назначайте щенков как контрольных или заражённых щенков.
2. На 3-й или 4-й день после родов записывайте вес всех щенков до вакцинации E. coli-lux или контролем PBS. Отдельте мать от щенков в это время, чтобы они не были перемещены во время заражения.
3. Внутри биобезопасности с помощью инсулиновой иглы аспирируют либо PBS, либо инокулюм E. coli-lux . Для этой работы использовались инокулы по 2 x 10⁶ и 7 x 10⁶ CFU на мышь. Держите инфекционный инокулум и PBS на льду до введения через подлопаточную инъекцию.
4. Положите новорождённого на чистую поверхность в капюшоне шкафа для биобезопасности и приподнимите кожу на затылке, словно чтобы погладить щенка.
5. В промежутке, созданном между кожей и мышцой животного, введите иглу, закосите вверх чуть ниже кожи и введите 50 мкл PBS или E. coli-lux. Одновременно освобождайте защемленную часть кожи, чтобы предотвратить обратный поток при инъекции.
6. Убирайте иглу медленно и аккуратно. После окончания инъекций возвращайте щенков к дамам. ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за анатомической стадии развития технически сложно проводить инъекции в хвостовую вену или внутрибрюшинные инъекции новорождённым на день 3-4. Таким образом, для этого исследования был выбран путь подлопатковой инфекции из-за простоты их выполнения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 мл инсулинового шприца	Coviden	1188128012	Инъекция инокулюма или PBS
Паста для татуировок животных	Кетчум	KI1482039	Идентификация животных
Animal Tattoo Ink Green Paste	Кетчум	KI1471039	Идентификация животных
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (экспрессирует люциферазу)	Н/Д	Н/Д	Построен внутри WVU
DPBS, 1X	Корнинг	21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar	Бектон, Дикинсон и компания	236950	Рост бактерий
IVIS Spectrum CT и программное обеспечение Living Image 4.5	Перкин Элмер	Н/Д	Интравитальная визуализация
ЛБ Броут, Леннокс	Биореагенты Fisher	BP1427-500	Рост бактерий