Обнаружение бактерий in situ в срезах дессенной ткани мышей

Аннотация

Источник: Choi, Y. S. и др. Обнаружение бактерий в тканях, вложенных в парафин, на месте с помощью дигоксин-зонда ДНК, направленного на 16S рРНК. J. Vis. Exp. (2015).

В этом видео демонстрируется обнаружение бактерий in situ в срезах десневой ткани мышей с помощью ДНК-зондов, маркированных дигоксином, направленных на бактериальную ДНК. Срез инкубируется с помощью зонда. Добавляются антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой, специфичные к дигоксину. Эндогенные фосфаты инактивированы, а окрашенный осадок получается при добавлении субстрата. Секция окрашивается, обезвоживается, очищается ксилолом и устанавливается перед микроскопической визуализацией бактерий.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этическому обзору животных.

1. Подготовка зонда

1. ПЦР-усиление зонда
   1. Для специфического для Porphyromonas gingivalis зонда амплифицируйте фрагмент ДНК P. gingivalis 16S рРНК с 343 б.. с помощью ПЦР, используя геномную ДНК P. gingivalis и следующие праймеры: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' и 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'. Выполнять усиления при следующих циклических условиях: 35 циклов при 95 °C в течение 30 с, 60 °C 30 с и 72 °C в течение 1 минуты 20 с, затем 5 минут при 72 °C.
   2. Амплифицируйте эубактериальный зонд с помощью фрагмента ДНК с 70 ударами (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTTGTTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCCCCAACGAGCCAACCC-3'), синтезированного в виде олигонуклеотида, и следующих праймеров: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' и 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'. Выполнять усиление при следующих циклических условиях: 40 циклов при 94°C в течение 30 с, 60 °C в 30 с и 72 °C в течение 1 минуты 20 с, затем 5-минутное удлинение при 72 °C.
   3. Осадьте продукты ПЦР (≥500 мкл), добавив 3 м ацетата натрия (pH 5,2) и 100% этанол (в соотношении 10:1:2) и инкубировав при -20 °C в течение 2 часов.
   4. Центрифугуйте смесь при 14 000 x g в течение 15 минут, затем ресуспензуйте гранулу в 100 мкл триэтиледиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) или буфера TE и измерьте концентрацию ДНК по оптической плотности на 260 нм.
2. Маркировка дигоксигенина (DIG) с помощью набора для маркировки и обнаружения ДНК DIG
   1. Смешайте 3 мкг зонда с водой до конечного объёма 15 мкл.
   2. Денатурируйте ДНК при 95 °C в течение 10 минут и быстро охлаждайте на льду.
   3. Добавьте 2 мкл смеси 10x гексануклеотида, 2 мкл смеси дезоксинуклеозидтрифосфата (dNTP) и 1 мкл фермента Кленова к 15 мкл денатурированной ДНК.
   4. Смешивайте и инкубуйте при 37 °C в течение 24 часов — 48 часов, а затем остановите реакцию, нагревая при 65 °C.
3. Проверьте чувствительность зонда, маркированного DIG, с помощью комплекта для маркировки и обнаружения ДНК DIG
   1. Вручную загрузите 1 мкл последовательного разбавления положительного контрольного зонда, входящего в комплект, и 1 нг зонда с маркировкой DIG на нейлоновую мембрану и сушите 5 минут при комнатной температуре (RT).
   2. Кратко замочите мембрану в двухкратном буфере с солевым раствором и натрием цитратом (SSC) (0,3 млн хлорида натрия или NaCl, 30 мМ натриевого цитрата, pH 7,0) и инкубируем мембрану при 80 °C в течение 1 часа, чтобы обездвижить ДНК.
   3. Кратковременно замочить мембрану в буфере малеиновой кислоты (MAB, 0,1 M малеиновая кислота, 0,15 M NaCl, pH 7,5) и инкубировать антителом, конъюгированным с анти-DIG щелочной фосфатазой (AP), разбавленным (1:5 000) в 6 мл блокирующего раствора, поданного в наборе в RT, в течение 30 минут.
   4. Промыйте мембрану MABT (MAB содержит 1% Tween 20) и нанесите 40 мкл раствора нитро-синего тетразолия/5-бромо-4-хлоро-3'-индолилфосфата (NBT/BCIP), смешанного с 2 мл детекторного буфера (0,1 M трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорида или Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M хлорида магния или_{MgCl 2}, pH 9,5) на мембрану на 1 минуту. Если чувствительность маркированного зонда неудовлетворительна, повторяйте шаги с 1.1.3 по 1.3.4.
   5. Измерьте концентрацию ДНК маркированного зонда (_{OD 260}) и отрегулируйте концентрацию до 100 нг мкл-1.
4. Проверьте специфику зонда с маркировкой DIG
   1. Образцы геномной ДНК (25 нг 3 мкл-1 на образец) различных бактериальных видов, включая бактерию, на которую нацеливается специфический зонд, при температуре 95 °C в течение 10 минут и быстро охлаждаются на льду.
   2. Вручную загрузите денатурированную ДНК на нейлоновую мембрану и сушите 20 минут на RT.
   3. Кратковременно замочите мембрану в двухкратном буфере SSC и инкубуйте мембрану при 80 °C в течение 2 часов, чтобы обездвижить ДНК.
   4. Заблокируйте мембрану блокировочным раствором на RT на 1 час.
   5. Разведите зонд при 1 нг мкл-1 в буфере гибридизации, денатурируйте разбавленные зонды и примените их к мембране.
   6. Инкубировать мембрану при 45 °C в течение 1 часа.
   7. Промой мембрану три раза с помощью 2x SSC-буфера.
   8. Ненадолго замочите мембрану в MAB.
   9. Инкубировать с антителом, конъюгированным с анти-DIG AP, разбавлённым (1:2 000) в 6 мл блокирующего раствора на RT в течение 1 часа.
   10. Промыйте мембрану MABT и нанесите 40 мкл раствора NBT/BCIP, смешанного с 2 мл буфера для обнаружения.
   11. Если зонд не достигает ожидаемой специфической точности, увеличивайте температуру гибридизации до тех пор, пока не будет достигнута специфическая точность.

2. Гибридизация in situ

Примечание: чтобы избежать высыхания образцов и реагентов, проводите все инкубации в увлажнённой камере, выстлованной влажными бумажными полотенцами.

1. Депарафинизация и регидратация срезов тканей
   1. Подготовьте срезы ткани толщиной 4 мкм из блоков, вложенных в парафин. Формалин, параформальдегид и фиксатив на основе цинка совместимы с этим протоколом.
   2. Подготовьте все реагенты с использованием воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC).
   3. Нагрейте слайды в сухой духовке при 60 °C в течение 30 минут и инкубируемые слайды на RT в течение 30 минут.
   4. Трижды погружать слайды в 100% ксилол на 5 минут; Каждый раз используйте свежий ксилол.
      Примечание: Выполните эту процедуру удаления воска в вытяжной капсуле с химическими парами.
   5. Погружайте в 100% этанол на 5 минут дважды, каждый раз используя свежий этанол, и регидратировать образцы в серийных растворах 90%, 80% и 70% этанола по 5 минут каждый.
   6. Погружайте слайды в воду, обработанную DEPC, на 1 минуту, а стекли — в обработанном DEPC фосфатно-буферный физиологический раствор или PBS (pH 7,4) в течение 6 минут.
2. Предварительные обработки срезов тканей
   1. Погружать слайды в соляную кислоту 0,1 N на 20 минут и промывать стекли в воду, обработанную DEPC, 30 секунд.
   2. Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг образцов с помощью восковой ручки.
      Примечание: размер гидрофобного барьера зависит от размера образцов. Поэтому объёмы используемых реагентов на следующих этапах варьируются в зависимости от размера образцов, но должны заполнять гидрофобный барьер (50 мкл для малых образцов и 400 мкл для крупных).
   3. Обрабатывайте образцы 50–400 мкл протеиназы K (1–10 мкг ^мл-1 в DEPC-обработанном PBS) в сухой печи при 37 °C в течение 30 минут, а стекли для промывания в обработанном DEPC 1x PBS в течение 1 минуты.
   4. Замачивайте стекли в 4% параформальдегиде в обработанном DEPC PBS на 10 минут, затем промывающие препараты в PBS, обработанном DEPC, на 1 минуту.
   5. Замачивать слайды в триэтаноламин-HCl (pH 8,0) с 0,5% уксусного ангидрида в течение 20 минут и промывать в воде, обработанной DEPC, 30 секунд.
3. Гибридизация с зондом и мойкой
   1. Погружите слайды в 2x SSC-буфер на 20 минут.
   2. Разбавить зонд с концентрацией 1 ^мкл-1 в буфере гибридизации (4x SSC, 50% [об/вол] формамида, 1x раствора Денхардта, 10% [масс/об] декстрансульфата, 0,1% [масс/об] натрия додецилсульфата, 0,4 мг сперматозоидов мл-1 лосося). Для отрицательных контролей смешайте помеченный зонд с 10-кратным избыточным количеством немаркированного зонда.
   3. Денатурируйте разбавленные зонды и наносите от 50 до 400 мкл на тканевые срезы. Наденьте накладку на затвор и запечатайте его лаком для ногтей.
   4. Тепловые слайды в ПЦР-машине при 90 °C в течение 10 минут и инкубируют слайды в увлажнённой камере на ночь (O/N) при 45 °C или при оптимальной температуре, определяемой на шаге 1.4.11.
   5. Охлаждайте стекли при 4 °C в течение 30 минут, снимайте заслоны на крышке и погружайте затворы в последовательный буфер SSC следующим образом: 4x SSC на 10 минут, предварительно прогретый (45 °C) 2x SSC на 20 минут, 2x SSC на 10 минут и 0,2x SSC на 10 минут.
4. Обнаружение с помощью анти-DIG AP-конъюгированного антитела
   1. Слайды для стирки в MABT на 5 минут.
   2. Заблокируйте 50–400 мкл раствора с 1% Tween 20 на 20 минут.
   3. Добавьте от 50 до 400 мкл антитела против DIG-AP, разбавленных в блокирующем растворе (1:1 000), и инкубировать при 37 °C в течение 90 минут.
   4. Стекли для стирки в MABT на 10 минут.
   5. Погрузите слайды в буфер обнаружения с 1% Tween 20 в течение 5 минут.
   6. Обрабатывайте 50–400 мкл левамизола 1 мМ (в буфере обнаружения с 1% Tween 20) в течение 5 минут для инактивации эндогенной щелочной фосфатазы.
   7. Распределите от 50 до 400 мкл предварительно смешанного раствора NBT/BCIP (разбавленного в буфере обнаружения в 1:100) на каждый образец и инкубируют стекли в увлажнённой камере на RT в течение 2–3 часов, пока полученный сигнал не станет удовлетворительным результатом.
   8. Прополосните стекли деионизированной водой, чтобы прекратить визуализацию, и нанесите 50–400 мкл 0,05% метилово-зелёного в качестве контрморилки при 37 °C в течение 10 минут.
   9. Прополосните стекла деионизированной водой, обезвожите в 100% этаноле и погрузите в ксилол.
   10. Нанесите 80 мкл крепящего раствора на каждую затворную форму и накройте с помощью накладок.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Уксусный ангидрид	Sigma	6404
50% раствор сульфата декстран	Миллипор	S4030
50-кратное решение Денхардта	Sigma	D2532
Диэтилпирокарбонат (DEPC)	Sigma	P159220
Набор для маркировки и обнаружения ДНК дигоксигенина (DIG)	Рош	11 093 657 910
Формамид	Sigma	F9037
ImmEdge™ Pen	Дако	H-400
Левамисол	Вектор	SP-5000
Хлорид магния	Sigma	246964
Малеиновая кислота	Sigma	M0375
Метилово-зелёный	Sigma	M6776
Параформальдегид	Sigma	P1648
Пермонт	Фишер	SP15-500
Раствор ДНК сперматозоидов лосося	Инвитроген	#15632-011
Хлорид натрия	Sigma	S9625
Цитрат натрия	Дуксан	D1420
Додецилсульфат натрия	Амреско	227
Триэтаноламин-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Исследование органики	3098T