Визуализация инфекции мочевыводящих путей в модели мыши с использованием биолюминесценции

Аннотация

Источник: Luyts, N. и др. Продольное наблюдение за инфекциями мочевыводящих путей и их лечение у мышей с использованием биолюминесцентной визуализации. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует индукцию и отслеживание инфекций мочевыводящих путей в мышиной модели с использованием биолюминесцентной E. coli , введённой в мочевой пузырь, где происходит бактериальная адгезия, инвазия и внутриклеточная репликация. Излучаемый свет от биолюминесцентного оперона служит маркером бактериальной нагрузки в реальном времени во время прогрессирования инфекции.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Прививка животных

1. Подготовка животных
   1. Выбирайте желаемый штамм мышей в зависимости от исследовательского вопроса и наличия линий выбивания, экспериментальных деталей и различий в восприимчивости к ИМП. Имейте в виду, что трансуретральная катетеризация у самок мышей проще. Не используйте животных младше 8 недель, так как они иммунологически незрелы. Здесь использовались 12-недельные самки C57Bl/6J.
   2. Заранее закажите животных и дайте им привыкнуть, желательно в течение 7 дней. Групповые домашние животные находятся в индивидуально вентилируемых клетках, при стандартных 12-часовых условиях света и темноты.
   3. Побрить брюшную область животных, чтобы ограничить потерю сигнала. Не используйте крем для удаления волос, так как он может быстро обжечь кожу животных. Удерживать животное, крепко сжимая загривку и задние конечности недоминирующей рукой, бриясь доминирующей рукой. В качестве альтернативы — бриться под анестезией изофлурана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животных брили за 2 дня до обследования, учитывая, что животные будут ухаживать за выбритым участком ещё больше.
   4. Обеспечивайте водой и стандартной едой ad libitum на протяжении всего эксперимента. Однако лишайте животных воды за 2 часа до инстилляции, чтобы минимизировать объём мочевого пузыря во время инстилляции.
   5. Установите стерильный наконечник ангиокатетера объёмом 24 г на шприц на 100 мкл и наполните шприц бактериальным раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить фоновую люминесценцию, получите базовое изображение перед инстилляцией (см. шаг 2 ниже).
2. Инстилляция животных
   1. Поместить животных в индукционную камеру и анестезировать их с помощью вдыхания изофлурана с чистым кислородом в качестве газа-носителя (индукция 3% и поддержание 1,5%).
   2. Поместите одно животное на рабочую поверхность в положении лежа на спине и поддерживайте стабильную анестезию изофлураном с помощью носового конуса во время инстилляции. Нанесите глазную мазь.
   3. Выведите остаточную мочу с помощью мягкого сжатия и круговых движений в надлобковой области. Очистите нижнюю часть живота 70% этанолом перед введением.
   4. Смажьте кончик катетера обычным физиологическим раствором. Положите указательный палец недоминантной руки на живот и аккуратно поднимите его вверх. Начните катетеризацию уретры под углом 90° (вертикально), а при обнаружении сопротивления наклоните её горизонтально перед дальнейшим введением (0,5 см).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не нажимайте на катетер силой, так как это повредит уретру. Мягкие поворотные движения могут быть полезны при установке катетера. С другой стороны, отсутствие сопротивления обычно указывает на ошибочное введение во влагалище.
   5. Проведите медленное (5 мкл/с) инстилляцию 50 мкл бактериального инокулюма (2 x 10⁷ CFU).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие объёмы или более быстрая инстилляция могут вызвать рефлюкс в почки. Во время практики синие чернила могут использоваться для оценки рефлюкса.
   6. После инстилляции держите шприц и катетер на месте ещё несколько секунд, а затем медленно втягивайте, чтобы предотвратить протечение. Фиксируйте любые нарушения, такие как высокая протечка или кровавый меатус, и при необходимости исключайте животных.
   7. Разместите животное в положении лежа на спине у носового конуса камеры визуализации и повторите предыдущие шаги 1.1.1-1.1.6 для всех оставшихся животных. Используйте по одному катетеру на каждую экспериментальную группу. Обязательно продолжайте анестезию и минимизируйте время между первым и последним животным.
   8. При необходимости вводите антибиотики или экспериментальные препараты до или после проведения визуализации (шаг 2). Например, для введения энрофлоксацина добавьте 40 мкл раствора энрофлоксацина (100 мг/мл) к 3,96 мл физиологического физиологического раствора, чтобы получить разбавление 1/100. Вводите 100 мкл/10 г подкожно в 9 утра и 17:00, чтобы ввести 10 мг/кг энрофлоксацина два раза в день в течение 3 дней.

2. Биолюминесцентная визуализация

1. Подготовка и выбор параметров визуализации
   1. Откройте программное обеспечение для получения BLI (см. Таблицу материалов) и нажмите Initialize в устройстве изображения (см. Таблицу материалов), чтобы протестировать камеру и систему контроллера сцены, а также охлать CCD-камеру до -90 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого процесса дверь запирается, и ход инициализации можно отслеживать на панели управления. Зелёный индикатор означает, что температура достигла -90 °C. Появляется предупреждение, если предупреждение будет выполнено до завершения инициализации.
   2. Убедитесь, что данные сохраняются автоматически: нажмите на автосохранение и выберите правильную папку.
   3. Выберите «Люминесценция» и «Сфотографировать». Проверьте настройки люминесценции по умолчанию: установите фильтр возбуждения на Блок и фильтр излучения на Открытие.
   4. Установите время экспозиции на Auto при съёмке первого снимка, особенно при ожидании тусклого сигнала, чтобы обеспечить достаточное количество фотонов. Для измерений in vivo и ярких сигналов установите время экспозиции на ~30 с. Если изображение насыщено, появится предупреждение. Если это происходит, сокращайте время экспозиции.
   5. Выберите средний Биннинг, F/стоп 1 и правильное поле зрения (FOV) (D для 5 животных).
   6. При съёмке мышей установите высоту объекта на 1 см.
   7. Нажмите «Добавить» три раза в панели управления приобретением, чтобы получить последовательность из трёх изображений в техническом репликации.
2. Визуализация
   1. Поместите мышей в камеру визуализации в положении лежа на спине и используйте носовой конус коллектора для поддержания анестезии (изофлуран 1,5%) на протяжении всего эксперимента. Сфотографируйте до 5 мышей одновременно и разделите животных с помощью светового перегородки, чтобы предотвратить отражение.
   2. Закройте дверь и нажмите «Приобрети», чтобы начать последовательность изображений.
   3. Заполните подробную информацию об эксперименте (дикие и нокаутные животные, лечение, день проведения визуализации и т.д.). Настройки изображения, такие как время экспозиции, сохраняются автоматически.
   4. Выведите мышей из камеры для визуализации и верните их в клетку. Проверьте полное восстановление после наркоза. Через несколько минут животные должны полностью проснуться и начать исследование. Не назначайте обезболивающие, так как это может помешать лечению ИМП.
   5. Верните клетки на вентилируемые стойки до следующего цикла визуализации. После завершения эксперимента усыпить животных с помощью асфиксии_CO2 или вывиха шейки матки. Сделайте это до восстановления анестезии с изофлураном, чтобы минимизировать стресс

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Вапорайзер для анестезии	Harvard Apparatus Limited	Н/Д	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Байтрил 100 мг/мл	Байер	Н/Д	Энрофлоксацин
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Жёлтый ангиокатетер, используйте стерильный пластиковый наконечник для инстилляции
Мыши C57Bl/6J	Жанвье	Н/Д
Центрифуга 5804R	Эппендорф	EP022628146
Dropsense 16	Освобождённые лаборатории	Тринеанский	для измерения OD 600 нм
Физиологический раствор с буфером фосфатов Dulbecco, Gibco	ThermoFisher Scientific	ССЫЛКА 14040-083
Этанол 70% денатурированный 5L	VWR international	85825360
Falcon 14 мл круглополистироловая трубка, с колпачком	Корнинг	352057
Falcon 50ml cellstart	Грейнер	227285
Шприц Hamilton GASTIGHT, PTFE luer lock, 100 мкл.	Сигма-Олдрич	26203	чтобы обеспечить медленное выращивание бактерий 50 мкл
Инокуляционная петля	Рот	6174.1	держатель: Ст. No 6189.1
Iso-Vet 1000 мг/г	Dechra Veterinary Products	Н/Д	Изофлуран
Система визуализации IVIS Spectrum In Vivo	ПеркинЭлмер	ССЫЛКА 124262	Устройство визуализации