Подготовка культуры агробактерий для передачи генов в клетки растений

Аннотация

Источник: Ши, Дж. и др., Скрининг и идентификация супрессоров заглушания РНК из секретируемых эффекторов патогенов растений. J. Vis. Exp .(2020)

В этом видео демонстрируется процедура подготовки культуры Agrobacterium tumefaciens путём индуцирования экспрессии генов вирулентности с помощью ацетосирингона, затем удаления антибиотиков через промывку и повторное суспензирование для создания готовой к трансформации суспензии для передачи генов в растительные ткани.

Протокол

1. Подготовка культуры Agrobacterium для инфильтрации

1. Выберите положительную колонию из пластины Лурия-Бертани (LB) и инокулируйте клетки в стеклянную трубку с 5 мл LB-среды, дополненной 50 мкг/мл канамицином и 50 мкг/мл рифампицином. Выращивайте клетки при 30 °C с встряхиванием при 200 об/мин в течение 24−48 часов.
2. Пересадить 100 мкл посева в 5 мл среды LB с добавлением тех же антибиотиков, 10 мМ 2-(N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES; pH 5,6) и 20 мкм ацетосирингона (AS). Выращивайте бактерии при 30 °C с встряхиванием при 200 об/мин в течение 16−20 часов.
3. Центрифугные ячейки при температуре 4000 x g в течение 10 минут. Вылейте супернатант и снова суспензируйте гранулу в 2 мл буфера 10 мМ_{MgCl 2} .
4. Повторите шаг 1.3, чтобы обеспечить полное удаление антибиотиков.
5. Определите плотность культуры Agrobacterium , измеряя оптическую плотность на 600 нм (_{OD 600}). Настройте на_{OD 600} с 1,5−2,0 с буфером_{MgCl 2} 10 мМ.
6. Добавьте 10 мМ MES (pH 5,6) и 150 мкм AS к итоговым культурам суспензии и инкубировать клетки в RT не менее 3 часов без встряхивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте финальные культуры подвески на ночь.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-морфолиноэтансульфоновая кислота (MES)	Biofroxx	1086GR500	Буфер
Ацетосирингон (AS)	Сигма-Олдрич	D134406-5G	Индукция агробактерий
Агар	Сигма-Олдрич	A1296-1KG	LB средний материал
Бакто Триптон	BD Biosciences	211705	LB средний материал
Экстракция дрожжей Bacto	BD Biosciences	212750	LB средний материал
Сульфат канамицина	Сигма-Олдрич	K1914	Антибиотики
Рифампицин	MP Biomedicals	219549005	Антибиотики
Хлорид натрия	Амреско	0241-10КГ	LB средний материал