Подготовка ткани мышиного мочевого пузыря для визуализации бактериальной инфекции

Аннотация

Источник: O'Brien, V. P. и др., Рецидивирующая инфекция мочевыводящих путей Escherichia coli, вызванная воздействием мочевого пузыря Gardnerella vaginalis у мышей. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео демонстрируется использование сканирующей электронной микроскопии для визуализации колонизации бактерий и взаимодействия хозяина с патогеном в эпителии мочевого пузыря в модели мышей до инфицирования.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Визуализация мочевого пузыря с помощью сканирующей электронной микроскопии

   ПРИМЕЧАНИЕ: Эту процедуру можно провести в любой момент времени, когда требуется визуализация уротелия. Как показано на рисунке 1 (фиолетовые квадраты), уропатогенные взаимодействия E. coli (UPEC) и уротелиального организма лучше всего визуализировать между 6 чами и 24 часами после инокуляции UPEC во время формирования резервуара, а уротелиальная эксфолиация, вызванная Gardnerella vaginalis , лучше всего визуализировать в период от 3 до 12 часов после второго контакта с G. vaginalis .

   1. Фиксация мочевого пузыря in situ
      1. Приготовьте фиксационный препарат непосредственно перед убором мочевого пузыря, добавив глутаральдегид (2,5% финальный) и параформальдегид (2% финальный) в буфер натрия какодилата толщиной 0,15 м с 2 мМ_CaCl2 при pH 7,4. Используйте параформальдегид и глутаральдегид из недавно открытых стеклянных ампул, так как оба фиксатора со временем окисляются в открытых контейнерах. ВНИМАНИЕ: Глутаральдегид токсичен, раздражает дыхательные пути и коррозионен; Параформальдегид горючий, канцерогенный, раздражительный и репродуктивный токсин; Натрий какодилат токсичен и канцерогенен.
      2. Для получения 50 мл фиксирующего раствора добавьте 6,25 мл 16% параформальдегида, 2 мл 50% глутаральдегида и 16,75 мл сверхчистой воды к 25 мл раствора натрия какодилата толщиной 0,3 м при pH 7,4 с 4 мМ CaCl₂.
      3. Разогрейте подготовленный фиксатор до 37 °C перед введением в мочевой пузырь.
      4. Заполните фиксационный шприц в туберкулиновый шприц и прикрепите катетер на конце, направленным на противоположные отметки шприца. Срежьте лишнюю трубку на 1-2 мм от конца иглы, стараясь не обнажать кончик иглы. Нажмите шприц, чтобы удалить пузырьки, и нажмите поршень для вытеснения воздуха и наполните катетер фиксатором по микроцентрифуге для сбора фиксатора для правильной утилизации.
      5. Анестезия и жертвоприношение мыши одобренным методом (например, вывих шейки матки под анестезией). Положите мышь на поверхность для препарирования с закреплёнными ножками (резинками или штифтами). Откройте тазовую область мыши щипцами и хирургическими ножницами, чтобы обнажить мочевой пузырь. Аккуратно отодвините соседний жир, но оставьте мочевой пузырь на месте.
      6. Держите шприц доминирующей рукой с иглой, направленной вниз, а скошенная игла и отметки от шприца направлены в сторону от вас. Окуните кончик катетера в стерильную смазку.
      7. Разместите кончик катетера у отверстия уретры, удерживая ствол шприца под углом 30-45° над телом мыши.
      8. Приложите вниз давление с очень маленьким движением по часовой стрелке кончиком и аккуратно введите катетер в уретру. Когда кончик катетера входит в уретру, завесите шприц к хвосту мыши, продолжая вводить катетер дальше в уретру, пока ствол шприца не станет параллелен рабочей поверхности. Весь ствол иглы катетера (не считая основания) должен попасть в мышь, размещая кончик катетера внутри просвета мочевого пузыря.
      9. Постепенно вводите 50-80 мкл фиксативного средства, вызывая надувание мочевого пузыря, словно шарик. Держите катетер на месте и немного поднимите шприц, наклоняя кончик вверх.
      10. Другой рукой откройте гемостат и провьете один штырь под иглу катетера в месте пересечения уретры. Частично закройте гемостат, пока он не соприкоснётся с иглой.
      11. Аккуратно выведите иглу катетера из мочевого пузыря, одновременно полностью зажимая и блокируя гемостат, чтобы предотвратить потерю фиксативного вещества.
      12. Держите гемостат так, чтобы он был параллелен рабочей поверхности, а мочевой пузырь лежал сверху. Аккуратно поднимите и аккуратно разрезайте под гемостатом (противоположная сторона мочевого пузыря), чтобы удалить мочевой пузырь, пока гемостат всё ещё прикреплён.
      13. Поместите мочевой пузырь и подключите гемостат к трубке Falcon с подогретым фиксатором. Убедитесь, что мочевой пузырь полностью погружен в жидкость и не прижат к стенкам трубки. Инкубировать при 4 °C в течение 24 часов.
   2. Обработка мочевого пузыря и визуализация с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM)
      1. Сагиттально разрезайте мочевой пузырь очищенным двусторонним лезвием бритвы и сделайте второй разрез тангенциально к гемостату, чтобы освободить мочевой пузырь. В результате получаются две «чашки» с половинным мочевым пузырём. Если на внешней стороне мочевого пузыря остались жировые подушечки, аккуратно их удалите.
      2. Промывайте половинки мочевого пузыря три раза (по 10 минут каждая) в буфере натрия какодилата (0,15 м, pH 7,4).
      3. Покрасить ткань 1% тетроксидом осмия в буфере какодилата толщиной 0,15 м в течение 1 часа при комнатной температуре. Осмий чувствителен к свету; Поэтому выполните этот шаг, обёрнув сосуд для окрашивателя в фольгу, чтобы сохранить тёмную атмосферу. ​
         ВНИМАНИЕ: Тетроксид осмия токсичен и коррозийно влияет на кожу. Сделайте этот шаг в вытяжке с перчатками.
      4. Промывайте половинки мочевого пузыря три раза (по 10 минут каждая) в ультрачистой воде. Во время этих этапов на поверхности воды иногда можно увидеть осмированное масло. Аспирируйте или отведите это, чтобы предотвратить загрязнение во время сушки.
      5. Обезвоживайте ткани путём погружения в градированную серию этанола (50, 70, 90, 100 и 100%) по 10 минут каждая.
      6. Сушите фиксированную ткань с помощью сушилки критической точки, выполняя 12 обменов_CO2 на самой низкой скорости. Установите все дополнительные настройки на замедление, кроме шага вентиляции, который настроен на быстрый.
      7. Разрежьте каждую половину мочевого пузыря снова чистой двусторонней бритвой, чтобы получить всего 4 кусочка, чтобы уменьшить кривизну образца для более эффективного покрытия, облегчить визуализацию в SEM и обнажить ткань, которая могла свернуться во время сушки.
      8. Прикрепите детали мочевого пузыря к проводящей углеродной клеевой вкладке на алюминиевом фланге и нанесите небольшое количество серебряного клея по нижней части контакта зубочисткой, стараясь не допустить попадания излишнего клея на внутреннюю поверхность мочевого пузыря.
      9. Используйте высоковакуумное покрытие с распылением образцов 6 нм иридия. Если образцы продолжают зарядиться, убедитесь, что проводящий путь нанесён на поверхность серебристой краской и нанесите дополнительно 4 нм иридия.
      10. Снимите образцы с помощью сканирующего электронного микроскопа. Хотя условия могут различаться в зависимости от используемого микроскопа, ускоряющее напряжение 3 КэВ при лучевом токе 200 пА и рабочем расстоянии 12-13 мм хорошо работало на Zeiss Merlin FE-SEM при использовании электронного детектора Эверхарта-Торнли (SE2).

Результаты

Рисунок 1. Схема модели мыши. Временная шкала выделена для отражения этапов или процедур модели, описанной в протоколе. Фаза 1 (оранжевый): Создание внутриклеточных уропатогенных резервуаров E. coli (UPEC). Мыши трансуретрально инъеки...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Иглы размером 30G x 1/2	BD	305106	Для катетеров
5 1/2" прямой щипца гемостат	МакКессон	487377	Фиксация мочевого пузыря in situ
ACE 600 Sputter coater	Leica		Обработка выборок SEM
Заготовка алюминиевого SEM	Тед Пелла	16111	Обработка выборок SEM
Хлорид кальция	EMS	12340	Фиксация мочевого пузыря in situ
Проводящая углеродная клеевая вкладка	Тед Пелла	16084-1	Обработка выборок SEM
Проводящая серебряная краска	Тед Пелла	16034	Обработка выборок SEM
Критическая сушилка CPD 300	Leica		Обработка выборок SEM
Металлический клипс цитоворонки	Симпорт	M964B	цитоспан анализы мочи
Этанол	EMS	15050	Обработка выборок SEM
Глюкоза	Sigma	G7528	Для среды роста G. vaginalis NYCIII
Глутаральдегид	EMS	16320	Фиксация мочевого пузыря in situ
Набор для окраски Hema 3	Фишер	23123869	Цитоспрутованный анализ мочи
HEPES	Cellgro	25-060-CL	Для среды роста G. vaginalis NYCIII
Иридий	Тед Пелла	91120	Обработка выборок SEM
Merlin FE-SEM	Zeiss		Сканирующий электронный микроскоп
Очиститель воды Milli-Q	Миллипор	IQ-7000	Обработка выборок SEM
Тетроксид осмия	EMS	19170	Обработка выборок SEM
Параформальдегид	EMS	15710	Фиксация мочевого пузыря in situ
Полиэтиленовые трубки	Интрамедик	427401	для катетеров
Протеозный пептон #3	Фишер	DF-122-17-4	Для среды роста G. vaginalis NYCIII
Двулезовое лезвие бритвы с покрытием PTFE	EMS	72000	Нарезка мочевого пузыря для СЭМ