Выделение и культивирование бактерий из эмбрионов данио для оценки нагрузки на инфекцию

Аннотация

Источник: Bernut, A. и др., Расшифровка и визуализация патогенеза и связки Mycobacterium abscessus в эмбрионах данио-рерио. J. Vis. Exp. (2015).

В этом видео демонстрируется протокол выделения и количественной оценки Mycobacterium abscessus из заражённого эмбриона данио-рерио. Процедура включает эвтаназию эмбриона, лизис тканей и гомогенизацию для освобождения бактерий, затем центрифугирование и ресуспензирование в буфере поверхностно-активного вещества. Наконец, бактериальная суспензия серийно разбавляется, покрывается на агар, дополненном антибиотиками, и инкубируется для формирования и количественной оценки колонии.

Протокол

1. Подготовка и хранение инокуля M. abscessus
   1. Условия роста M. abscessus
      1. Выделить M. abscessus из глицеролового запаса -80°C на агар Middlebrook 7H10, содержащий 10% OADC и 0,5% глицерина (7H10OADc), дополняя соответствующий антибиотик в зависимости от маркера резистентности, который переносит вектор, кодирующий флуоресцентный белок. Инкубировать тарелки при 30 °C в течение 4-5 дней.
      2. Возьмите флоресцентно-положительную микобактериальную колонию и инокулируйте 1 мл бульона Middlebrook 7H9, дополненный OADC, 0,2% глицерила, 0,05% Tween 80 (7H9OADc/T) необходимым антибиотиком в стерильной пластиковой трубке объемом 15 мл. Инкубировать при 30 °C в течение недели без встряхивания.
         ПРИМЕЧАНИЕ: До 80 лет ограничивает скопление и скопление бактерий.
      3. Реуспензировать предкультуру, полученную в 2,1,2 дюйма в 50 мл Middlebrook 7H9OADc/T в колбах для тканевой культуры объёмом 150 см², до окончательного 0,1_{OD 600} (примерно 5,107 бактерий/мл) и дальше инкубировать при 30 °C в течение 4 дней для получения экспоненциально растущей культуры (_{OD 600} = 0,6–0,8).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы минимизировать скопление, особенно грубого варианта, инкубация не должна превышать 5 дней. Гладкий и шероховатый варианты демонстрируют схожий темп роста.
2. Подготовка инокуля M. abscessus
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за высокой склонности грубого M. abscessus образовывать крупные агрегаты и образовывать пуповины, требуется специальное лечение для получения однородной и количественно контролируемой инокулы перед микроинъекциями в эмбрионы. Эта обработка также применяется к гладким бактериям, которые образуют заполнители, хотя и в меньшей степени, чем грубый штамм.
   1. Собирать экспоненциально растущие культуры из колб для тканевой культуры объёмом 150 см² путём центрифугации при 4 000 x g в течение 15 минут в стерильной пластиковой трубке объемом 50 мл и повторно суспензировать бактериальную гранулу в 1 мл 7H9OADc/T. Аликвот 200 мкл бактериальных суспензий в микроцентрифугные трубки объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с малыми объёмами в шприцах по 1 мл необходима для получения высокооднородных суспензий.
   2. Гомогенизуйте бактериальные суспензии иглой 26-G (15 последовательностей вверх-вниз), затем соникуйте три раза в течение 10 секунд (с перерывами по 10 секунд между каждой последовательностью) с помощью водяного соникатора. Добавьте 1 мл 7H9OADc/T и ненадолго вооружитесь в вихрь. Центрифуга 3 минуты при 100 x g.
   3. Аккуратно соберите супернатанты, содержащие микобактерии, чтобы избежать комков, и объедините однородные суспензии в стерильную пластиковую трубку объемом 50 мл.
   4. Проверьте визуально наличие потенциально оставшихся бактериальных агрегатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если агрегаты всё ещё присутствуют, переходите к дополнительному этапу центрифугации при 100 x g в течение 2 минут и собирайте супернатант.
   5. Центрифугуйте подвеску при 4000 x g в течение 5 минут, затем подвесьте пеллету в 200 мкл 7H9OADc/T и переходите к впрыску.
   6. Определите конечную концентрацию бактерий путём нанесения серийных разбавлений (в 1x PBST) на агаре 7H10OADc и подсчёта единиц формирования колоний (CFU) после 4 дней инкубации при 30 °C. Для каждой новой партии следует определять CFU.
   7. Приготовьте замороженные бульоны из инокулы, храня 5 мкл аликвотов при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка CFU замороженных аликвотов с температурой -80°C является необходимым условием для определения точного количества жизнеспособных бактерий, поскольку замораживание/оттаивание может повлиять на жизнеспособность инокулума бактерий. Эти замороженные инокулы готовы к последующему применению. Поскольку все аликвоты содержат одинаковое количество CFU, они позволяют воспроизводимо вводить бактерии из одного эксперимента в другой.
3. Контроль качества инокуля
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание по методу Зиля-Нильсена (специфическое для микобактерий) может использоваться для сравнения качества бактериальных суспензий до и после процедур гомогенизации.
   1. Найдите и распределите одну каплю гомогенизированной бактериальной суспензии на стеклянном стекле и дайте ей полностью высохнуть. Зафиксируйте мазок минимум на 30 минут на горячей плитке с температурой 65-70 °C и окрашивайтесь с помощью протокола окрашивания Ziehl-Neelsen.
   2. Осмотрите бактериальный мазок с помощью микроскопа с помощью объектива 100X и сравните с мазком необработанной бактериальной суспензии (рисунок 1).

2. Подготовка эмбрионов данио-рерио.

1. Нерест и сбор икри данио-рерио.
   1. За день до нереста, разведите взрослых данио, помещая 2 самцов и одну самку (обычно соотношение 2:1 обеспечивает оптимальное оплодотворение) в камеру для размножения, состоящую из отдельного аквариума с корзиной для сбора яиц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Корзины для сбора яиц используются для защиты яиц от съедания родителями и облегчения их сбора.
   2. При 1 hpf собирайте только хорошо развитые эмбрионы в чашке Петри диаметром 100 мм, наполненную водой из 25 мл синей рыбы (максимум 100 эмбрионов на блюдо) и поддерживайте их при температуре 28,5 °C. Неоплодотворённые яйца выбрасываются.
2. Подготовка эмбрионов данио для инъекций
   1. Примерно через 24 часа после оплодотворения (HPF) дехорионируйте эмбрионы тонким пинцетом в чашке Петри диаметром 100 мм и поддерживайте их при температуре 28,5 °C.
   2. Соберите 30-48 эмбрионов HPF с помощью пипетки и переместите их в камеру позиционирования в форме буквы «V», наполненную 25 мл рыбьей воды с содержанием 270 мг/л трикаина. Правильно размещайте эмбрионы в каналах с помощью самодельного инструмента для микрозагрузчика (самодельного обрезанного микрозагрузчика), оптимизированного для более простой микроманипуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для внутривенных инъекций в хвостовую вену или спинную сторону вверх для инъекций мышц хвоста.

3. Процедура микроинъекций

ПРИМЕЧАНИЕ:. Для оценки хронологии инфекции M. abscessus (выживаемость, бактериальная нагрузка, кинетика и характеристики инфекции) предпочтительнее делать инъекции в хвостовую вену эмбрионов 30 HPF. Для визуализации рекрутации иммунных клеток инъекции проводятся в локализованных участках, например, в хвостовые мышцы эмбриона с мощностью 48 hpf.

1. Разведите микобактериальный инокулум в 1 разе PBST (в зависимости от количества вводимого КФУ), содержащего 10% красного фенола для проверки правильной инъекции.
2. Загрузите иглу для микрокапилляров 5-10 мкл бактериального инокулюма с помощью наконечника микрозагрузчика, подключите иглу для микроинъекции к держателю трёхмерного микроманипулятора, подключённого к инжектору, и сломайте верхнюю часть иглы тонким пинцетом, чтобы получить диаметр отверстия 5-10 мкм.
3. Калибруйте объём впрыска путём регулировки давления микровпрыска (20-50 гПа) и времени (0,2 сек).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемый объём инъекции калибруется визуальным определением диаметра капли, выброшенной в желток эмбриона.
4. Для инъекции в хвостовую вену разместите эмбрион так, чтобы вентральная сторона была обращена к игле, и кончик иглы близко к урогенитальному отверстию, нацеливаясь на хвостовую вену, и аккуратно вводите кончик иглы в эмбрион, пока он не проткнет только область хвостовой вены. Доставьте желаемый объём бактериального препарата, обычно 1-3 нл, содержащий около 100 КОЕ/нл.
5. Для внутримышечной инъекции разместите эмбрион так, чтобы спинная сторона была обращена к игле, положите иглу на один сомите и введите небольшой объём (1 nl) инокулума.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается инъекций в каудальную вену, внутримышечные инъекции также сложно выполнять. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать перегрузки, которая может повредить окружающие ткани.
6. В конце процедуры инъекции контролируйте размер инокулума, введя тот же объём бактериальной суспензии в капле стерильного PBST, затем накладайте на 7H10OADc и подсчитывая CFU. Около 100 эмбрионов могут быть введены иглой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку грубый M. abscessus может продолжать образовывать в игле заполнения, инъекции необходимо делать сразу после подготовки инокулума.
7. Переместить заражённых рыб по отдельности на пластины с 24 колодцами, содержащие 2 мл/скважину рыбьей воды, и инкубировать при 28,5 °C. Эмбрионы, введённые 1-3 nl 1X PBS, могут использоваться в качестве контроля.
8. Правильное заражение флуоресцентных бактерий в эмбрионах контролируется с помощью флуоресцентного микроскопа.

4. Количественная оценка бактериальной нагрузки

1. Определение с помощью перечисления CFU
   1. В нужное время собрать группы инфицированных эмбрионов (по 5 на каждое состояние) в микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 мл (1 эмбрион/пробирка), криоанестезировать эмбрионы инкубацией на льду в течение 10 минут и эвтаназии с помощью передозировки трикаина (300-500 мг/л)
   2. Промыйте эмбрионы стерильной водой дважды и выведите их в новую трубку. Лизуйте каждый эмбрион 2% Triton X-100, разбавленной в 1X PBST, используя иглу 26G и униформизуйте суспензию до полного лизиса. Центрифугуйте подвеску и повторно подвесьте пеллету при 1X PBST с 0,05% Tween 80. Последовательные разбавления гомогенатов покрыты на Middlebrook 7H10OADc и дополняются BBL MGIT PANTA, по рекомендации поставщика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: M. abscessus более восприимчив к лечению NaOH, чем M. marinum. Деконтаминация рыбных лизатов без нарушения роста M. abscessus успешно достигается с помощью антибиотикового коктейля BBL MGIT PANTA.
   3. Инкубировать пластины в течение 4 дней при 30 °C и считать колонии.

Результаты

Рисунок 1. Подготовка распространённой инокулы M. abscessus.Окрашивание Ziehl-Neelsen вариантов R или S, выращиваемых на среде бульона до любой обработки (верхние панели) или после обработки (нижние панели) для у...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BBL MGIT PANTA	BD Biosciences	245114
Бычий сывороточный альбумин	Euromedex	04-100-811-E
Каталаза из печени крупного рогатого скота	Сигма-Олдрич	C40
Difco Middlebrook 7H10 Агар	BD Biosciences	262710
Бульон Difco Middlebrook 7H9	BD Biosciences	271310
Этил3-аминобензоатная метанесульфонатная соль (трикаин)	Сигма-Олдрич	A5040
Олеиновая кислота	Сигма-Олдрич	O1008
Параформальдегид	Delta Microscopie	15710
Фенол Ред	Сигма-Олдрич	319244
Tween 80	Сигма-Олдрич	P4780
Агар	Gibco Life Technology	30391-023
Агароза с низким плавлением	Сигма-Олдрич
Мгновенные морские соли	Aquarium Systems Inc
Боросиликатные стеклянные капилляры	Sutter instrument Inc	BF100-78-10	1 мм O.D. X 0,78 мм I.D.
Устройство для вытягивания микропипеток	Sutter Instrument Inc		Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Микроинжектор	Tritech Research		Цифровой микроИНЖЕКТОР, MINJ-D
Пинцет	Sciences Tools inc		Dumont # M5S
Советы по микрозагрузчикам	Эппендорф