Моделирование патогенеза Aeromonas у C. elegans с помощью анализа выживаемости

Аннотация

Источник: Чен, Й. и др. Оценка вирулентности и патогенезу инфекции Aeromonas в модели Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp . (2018)

В этом видео демонстрируется тест на выживаемость с использованием C. elegans для моделирования патогенеза Aeromonas , при котором пероральное употребление бактерии приводит к кишечной инфекции и смертности, позволяя количественно оценивать вирулентность бактерий в живой системе хозяина.

Протокол

1. Анализ выживаемости C. elegans с помощью Aeromonas

1. В день посева червей L1 на ENGM (обогащённой среде роста нематод), распространяемой E. coli OP50, выберите по одной колонии каждого из четырёх штаммов Aeromonas или E. coli OP50 и выращивайте бульоном по 2 мл фунтов соответственно при 37 °C в течение 16 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать загрязнения, этот этап следует выполнять в ламинарной вытяжной вытяжке. Здесь использовались следующие бактериальные штаммы: E. coli OP50 — обычный источник пищи C. elegans. A. dhakensis AAK1 — первый полностью секвенированный клинический патогенный изолят A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 и A. caviae A2-9307121 являются репрезентативными клиническими изолятами из Национальной университетской больницы Чэн Кунг.
2. Измерьте поглощение бактериального_{бульона OD 600} (оптическая плотность при 600 нм) и скорректируйте уровень бактериального бульона до_{OD 600} = 2.0 с бульоном LB.
3. Наместите и распределите 30 мкл бактериального бульона на каждую 6-см пластину NGM (среда роста нематод). Культивируйте тарелки при комнатной температуре на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления NGM растворите 3 г NaCl (хлорид натрия), 2,5 г бактериального пептона и 20 г агар в 1 л деионизированной воды. Автоклав при 121 °C в течение 20 минут. Дождитесь, пока температура остынет до 55 °C в водяной бане, затем добавьте 1 мл 1 M CaCl₂ (хлорид кальция), 1 мл 1 M_{MgSO 4} (сульфат магния), 1 мл 5% холестерина в этаноле и 25 мл буфера фосфатов. Помешайте, чтобы хорошо смешать.
4. В день, когда черви L1 вырастают до стадии L4, случайным образом выберите и перенесите 50 червей на пластину NGM с каждым из четырёх штаммов Aeromonas или E. coli OP50.
5. Инкубировать пластины NGM при 20 °C до завершения анализа.
6. Перенесите всех живых червей на недавно подготовленную пластину NGM с бактериями и считайте количество живых, мёртвых и сенсорных червей каждый день, пока последний червь не умрёт.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно перемещайте червей на свежеприготовленную пластину NGM для поддержания инфекции, даже если используются стерильные черви (например, GLP-4 или с FudR).
7. Постройте график кривых выживаемости на основе ежедневного расчёта данных.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шейкер-инкубатор	ЙИХ ДЕР	LM-570R	Инкубация бактерий
NaCl	SIGMA	31434	Подготовка на основе культурных средств
MgSO₄	SIGMA	M7506	Подготовка на основе культурных средств
Агар	Difco	214530	Подготовка на основе культурных средств
CaCl₂	SIGMA	C1016	Подготовка на основе культурных средств
Холестерин	SIGMA	C8503	Подготовка на основе культурных средств
Пластина Петри диаметром 6 см	ALPHA PLUS	46	Подготовка тарелки агара
Бактериальный пептон	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Подготовка на основе культурных средств
FudR	SIGMA	1271008	Подготовка на основе культурных средств
Микроскопическая система	Nikon	Эклипаза Ti инвертирована	Микроскопическая визуализация