Методическая статья

Микротитровальные Блюдо образование биопленки Пробирной

118.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2437

⸱

30 января 2011 г.

1Microbiology and Immunology, Dartmouth Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Анализ описывает быстрый способ для измерения раннего образования биопленки у бактерий и грибков. Этот метод использует планшет в качестве субстрата для микробной образование биопленки и биопленки визуализируется использованием штамма кристаллический фиолетовый. Препарат обеспечивает либо качественных или количественных тест для раннего образования биопленки.

Аннотация

Биопленки представляют собой сообщества микробов, прикрепленных к поверхностям, которые встречаются в медицинской, промышленной и природной среде. Фактически, жизнь в биопленке, вероятно, является преобладающим способом роста микробов в большинстве сред. Зрелые биопленки обладают несколькими характерными особенностями. Микробы в биопленках обычно окружены внеклеточным матриксом, который обеспечивает структуру и защиту сообщества. Микробы, растущие в биопленке, также имеют характерную архитектуру, обычно состоящую из макроколоний (содержащих тысячи клеток), окруженных заполненными жидкостью каналами. Микробы, выращенные в биопленках, также известны своей устойчивостью к ряду антимикробных средств, включая клинически значимые антибиотики.

Анализ в микротитрационном планшете является важным инструментом для изучения ранних стадий формирования биопленок; он применялся преимущественно для исследования бактериальных биопленок, хотя данный метод использовался и для изучения формирования грибковых биопленок. Поскольку в этом анализе используются статические условия периодического культивирования, он не позволяет формировать зрелые биопленки, которые обычно наблюдаются в системах с проточной камерой. Тем не менее, данный анализ оказался эффективным для идентификации многих факторов, необходимых для инициации формирования биопленок (например, жгутиков, пилей, адгезинов, ферментов, участвующих в связывании и метаболизме cyclic-di-GMP), а также генов, участвующих в продукции внеклеточных полисахаридов. Кроме того, опубликованные работы указывают на то, что биопленки, выращенные в микротитрационных планшетах, приобретают некоторые свойства зрелых биопленок, такие как толерантность к антибиотикам и устойчивость к эффекторам иммунной системы.

Этот простой анализ в микротитрационном планшете позволяет изучать формирование биопленки на стенках и/или дне лунок. Благодаря высокой пропускной способности данный метод полезен для генетического скрининга, а также для тестирования образования биопленок различными штаммами при различных условиях культивирования. Варианты этого анализа использовались для оценки раннего формирования биопленок широким спектром микроорганизмов, включая, помимо прочего, псевдомонад, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria и грибы.

В описанном здесь протоколе мы сосредоточимся на использовании данного метода для изучения формирования биопленок модельным организмом Pseudomonas aeruginosa. В этом анализе степень образования биопленки измеряется с помощью красителя кристаллического фиолетового (CV). Тем не менее, для количественного определения образования биопленок при использовании метода в микротитрационных планшетах было описано множество других колориметрических и метаболических красителей. Простота, низкая стоимость и гибкость метода в микротитрационных планшетах сделали его важным инструментом для изучения биопленок.

Протокол

1. Рост биопленки

  1. Рост культуры дикого типа синегнойной палочки или мутантный штамм в течение ночи в богатой среде (т.е. LB)
  2. Развести более 1:100 культуры ночь в свежую среду для биопленки анализов. Стандартной среде анализа биопленки для P. палочки М63 является минимальным среде, дополненной сульфата магния, глюкозы и casamino кислот (см. таблицу). В качестве альтернативы биопленки способствующих среда, которая стимулирует рост менее планктонных и более надежные биопленки, глюкозу и кислоты casamino может быть заменен на аргинин в качестве единственного источником углерода и энергии.
  3. Добавить 100 мкл разведения на лунку в 96-блюдо. Для количественного анализов, мы обычно используем 4-8 повторить скважин для каждой процедуры.
  4. Инкубируйте планшет в течение 4-24 часов при 37 ° C.

2. Окрашивание биопленки

  1. После инкубации дампа клетки, поворачивая пластину снова и вытряхивая жидкости.
  2. Осторожно погрузите пластину в небольшой ванной воды (то есть использование дне пипетки коробки наконечник для P1000 pipetmen как ванна). Вытряхните воды. Повторите эту процедуру второй раз. Этот шаг поможет удалить одиноких клеток и СМИ компоненты, которые могут быть окрашены в следующем шаге, а также значительно снижает фоновый окрашивания.
  3. Добавить 125 мкл 0,1% раствора кристаллического фиолетового в воде в каждую лунку планшета. Надевайте перчатки и халат, делая решение. Соблюдайте осторожность при взвешивания резюме в порошок гигроскопичны и легко пятна одежды, кожи и т.д.
  4. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
  5. Промыть пластины 3-4 раза водой путем погружения в ванну с водой, как указано выше, вытряхнуть и промокните энергично на стопку бумажных полотенцах, чтобы избавиться пластина все лишние клетки и красителя.
  6. Включите планшет с ног на голову и высушить в течение нескольких часов или на ночь.
  7. Для качественного анализов, скважин можно сфотографироваться в сухом состоянии.

3. Количественная биопленки

  1. Добавить 125 мкл 30% уксусной кислоты в воде в каждую лунку планшета для растворения резюме.
  2. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
  3. Передача 125 мкл солюбилизированного резюме на новое блюдо с плоским дном микротитровальных.
  4. Количественная поглощения в ридер при 550 нм с использованием 30% уксусной кислоты в воде, как пустой.

4. Представитель Результаты:

Рисунок 1
Рисунок 1. Показывает, представитель результат для образования биопленки анализов проводится для синегнойной палочки, Pseudomonas флуоресцирующей и золотистый стафилококк. (А) вид сбоку и с биопленки П. палочки (8 часов, 37 ° С). (B), вид сбоку и с биопленки П. Циогезсепз (6 часов, 30 ° С). (C) сверху вниз из биопленки образуются С. золотистый в плоскодонных планшет (две скважины, 24 часа, 37 ° С). P. палочки и P. Циогезсепз оба подвижных организмов и форме биопленки на поверхности раздела воздух-жидкость. Золотистого стафилококка является неподвижные и формы биопленки на дне колодца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот метод может быть модифицирована для использования в самых разнообразных видов микроорганизмов. Подвижные микробы обычно придерживаются стен и / или днища колодцев, в то время как неподвижные микроорганизмы обычно придерживаются на дно скважины. Оптимальные условия для образования биопленки (т.е. ростовой среды, температуры, времени инкубации) должны быть определены эмпирически для каждого микроба. Я рекомендую выполнять несколько повторяет для каждого штамма или состояния (4-8), в том числе и положительного контрол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Спасибо Шерри Кучма, Пит Ньюэлл и Роберт Шанкс для обеспечения изображения на рисунке 1. Эта работа была поддержана NIH грант R01AI083256 в ГАО

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 X M63Приготовьте 5-кратный (5X) стоковый раствор среды M63, растворив 15 г KH2ПО4, 35 г K2Оптимизация гиперпараметров4 и 10 г (NH4)2СО4 в 1 л воды. Этот стоковый р-р–Автоклавирование не требуется, хранить при комнатной температуре. Разведите 5-кратный стоковый раствор в пропорции 1:5, автоклавируйте, охладите, затем добавьте необходимые компоненты.
KH2ПО4Fisher ScientificP285-500
К2ОПГ (оптимизация гиперпараметров)4Fisher ScientificP288-500
(NH4)2СО4Sigma-AldrichA5132
Сульфат магнияFisher ScientificM63-500Добавьте до конечной концентрации 1 мМ. Приготовьте стоковый раствор с концентрацией 1 М в воде и подвергните автоклавированию.
ГлюкозаFisher ScientificD16-3Добавьте до конечной концентрации 0,2%. Приготовьте 20% стоковый раствор в воде и автоклавируйте.
Казеиновые аминокислотыBD Biosciences223050Добавьте до конечной концентрации 0,5%. Приготовьте 20% стоковый раствор в воде и автоклавируйте.
АргининSigma-AldrichA5131Добавьте до конечной концентрации 0,4%. Приготовьте 20%-ный стоковый раствор в воде и стерилизуйте фильтрованием. Этот альтернативный источник углерода/энергии может заменить глюкозу и казаминокислоты.
Микротитрационные планшетыBD Biosciences353911Falcon 3911, Microtest III, гибкие планшеты для анализа, 96-луночные, с U-образным дном, нестерильные, без обработки для культивирования тканей.
Крышки для микротитрационных планшетовBD Biosciences353913Крышки можно использовать повторно, очистив их 95-процентным раствором этанола в воде.
Кристаллический фиолетовыйSigma-Aldrich229641000Приготовьте 0,1% раствор в воде.

Ссылки

  1. O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
  2. O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle, R. J. , Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).
  3. Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  4. Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
  5. Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
  6. Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
  7. Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
  8. Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
  9. Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
  10. Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
  11. Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Pseudomonas aeruginosa96

Похожие статьи