Оценка бактериальной вирулентности с помощью жидкостного токсичного теста C. elegans

Abstract

Источник: Чен, Й. и др. Оценка вирулентности и патогенезу инфекции Aeromonas в модели Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp . (2018).

В этом видео демонстрируется жидкий токсичный анализ C. elegans с помощью Aeromonas — метод, используемый для оценки вирулентности бактерий путём измерения выживаемости червей в жидкой среде с ограничением питательных веществ. Анализ выявляет специфическую патогенность штамма на основе степени повреждений, вызванных токсинами, и смертности у C. elegans.

Protocol

1. Жидкий токсичный анализ C. elegans с помощью Aeromonas

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать загрязнения, следует выполнять этапы в ламинарном вытяжном выпоке.

1. На следующий день после посева червей L1 на плите ENGM (обогащённая среда роста нематод) с E. coli OP50, выберите по одной колонии каждого из четырёх штаммов Aeromonas и E. coli OP50, и выращивайте бульоном по 5 мл фунтов при температуре 37 °C в течение 16 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе использовались следующие штаммы бактерий: E. coli OP50 — обычный источник пищи для C. elegans. A. dhakensis AAK1 — первый полностью секвенированный клинический патогенный изолят A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 и A. caviae A2-9307121 являются клиническими изолятами из Национальной университетской больницы Чэн Кунг.  
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления обогащённого NGM (ENGM) растворите 3 г NaCl, 5 г бактериального пептона, 1 г экстракта дрожжей и 30 г агар в 1 л деионизированной воды. Автоклав при 121 °C в течение 20 минут. Дождитесь, пока температура остынет до 55 °C в водяной бане, затем добавьте 1 мл 1 M CaCl₂, 1 мл 1 M MgSO₄, 1 мл 5% холестерина в этаноле и 25 мл буфера фосфатов. Помешайте, чтобы хорошо смешать.
2. Измерьте поглощение бактериального бульона при_{OD 600} .
3. Центрифугуйте бактериальный бульон в концентрации 3500 г в течение 15 минут, чтобы удалить бульон LB. Суспензируйте бактерии и отрегулируйте бактериальный бульон до_{OD 600} = 3.0 с S-средой. Добавьте 195 мкл бактериального бульона в S-среде как минимум в 8 колодец пластины на 96 лунок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав S-среды: Для приготовления S-среды смешать 40 мл S Basal, 0,4 мл 1 M цитрат калия, 0,4 мл раствора следовых металлов, 0,12 мл 1 M_{CaCl 2}, 0,12 мл 1 M_{MgSO 4}, 40 мкл 5% холестерина в этаноле и 1 мл 8 мМ FudR перед использованием.
4. Смойте черви L4 на пластине ENGM E . coli OP5 с помощью среды M9. Отрегулируйте червячный раствор до концентрации 5 червей на мкл и добавьте 5 мкл червячного раствора в каждую скважину пластины с 96 лунками. Убедитесь, что в каждой скважине примерно 25 червей.
5. Инкубировать пластину с 96 лунками на шейкере при 200 об/мин при 25 °C.
6. Посчитайте количество живых и мёртвых червей после 24, 48 и 72 часов. Рассчитайте показатели выживаемости каждой скважины по следующей формуле: (Живые черви/Общее количество червей) × 100%.
7. Нарисуйте график рассеяния с помощью ежедневного расчёта данных.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Шейкер-инкубатор	ЙИХ ДЕР	LM-570R	Инкубация бактерий
NaCl	SIGMA	31434	Подготовка на основе культурных средств
MgSO₄	SIGMA	M7506	Подготовка на основе культурных средств
Агар	Difco	214530	Подготовка на основе культурных средств
CaCl₂	SIGMA	C1016	Подготовка на основе культурных средств
Холестерин	SIGMA	C8503	Подготовка на основе культурных средств
Этанол	SIGMA	32205	Подготовка на основе культурных средств
KOH	SIGMA	P5958	Подготовка на основе культурных средств
Пластина Петри диаметром 6 см	ALPHA PLUS	46	Приготовление агаровой тарелки
96-колодцевая пластина	FALCON	353072	жидкий анализ
Бактериальный пептон	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Подготовка на основе культурных средств
Экстракт дрожжей	SIGMA	92144	Подготовка на основе культурных средств
Лимонная кислота•H₂O	SIGMA	C1909	Подготовка на основе культурных средств
Трикалий цитрат•H₂O	SIGMA	104956	Подготовка на основе культурных средств
FudR	SIGMA	1271008	Подготовка на основе культурных средств
Динатриевый EDTA	SIGMA	E1644	Подготовка на основе культурных средств
Триптон	SIGMA	16922	Подготовка на основе культурных средств
Микроскопическая система	Nikon	Эклипаза Ti инвертирована	Микроскопическая визуализация
Научная CCD-камера	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Микроскопическая визуализация