Анализ мышечной некроза у C. elegans, вызванный патогенным штаммом Aeromonas

Аннотация

Источник: Chen, Y. и др., Оценка вирулентности и патогенезу инфекции Aeromonas в модели Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp .(2018)

В этом видео демонстрируется мышечный некроз у C. elegans (Caenorhabditis elegans) с использованием патогенных штаммов Aeromonas . Подавая зелёных флуоресцентных белков (GFP) червей, экспрессирующих ГФП, на пластинах с семенами Aeromonas, анализ моделирует бактериальную инфекцию и выявляет повреждение тканей с помощью флуоресцентной визуализации. Постепенная потеря мышечной структуры и сигнала GFP указывает на некротический ответ, вызванный Aeromonas.

Протокол

1. Caenorhabditis elegans Мышечный некроз с помощью Aeromonas

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать загрязнения, эти этапы следует выполнять в ламинарном выпоке.

1. В день посева червей L1 на обогащённой среде роста нематод (ENGM), распространённом Escherichia coli OP50, выберите по одной колонии каждого из четырёх штаммов Aeromonas и E. coli OP50 и культивируйте бульон Luria-Bertani (LB) по 2 мл при 37 °C в течение 16 часов. ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались следующие штаммы бактерий: E. coli OP50 — нормальный пищевой источник C. elegans. A. dhakensis AAK1, первый полностью секвенированный клинический патогенный изолят A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 и A. caviae A2-9307121 являются репрезентативными клиническими изолятами из Национальной университетской больницы Чэн Кунг.
2. Измерьте поглощение бактериального бульона при_{OD 600} и скорректируйте бульон на OD₆₀₀ = 2.0 с бульоном LB. Обнаружить и распределить 30 мкл бактериального бульона на 6-сантиметровых пластинах среды роста нематоды (NGM). Культивируйте тарелки при комнатной температуре на ночь.
3. В день, когда черви L1 достигнут стадии L4, передайте по 50 червей на каждую пластину NGM вместе с каждым из четырёх штаммов Aeromonas или E. coli OP50. Инкубировать NGM-пластины при 20 °C. Переносить червей каждые 24 часа на недавно подготовленные NGM-пластины с бактериями.
4. Сделайте изображения мышц с помощью флуоресцентного микроскопа.
   1. Случайным образом выберите 10 червей на 2% агарозном геле в среднем M9 на слайде. Парализуйте червей с помощью 2 мкл азида натрия 1% в среде M9 на агарозе менее 5 минут перед съёмкой.
   2. Наместите накладку и сделайте мышечные изображения с помощью фильтра зелёного флуоресцентного белка (GFP) на флуоресцентном микроскопе с камерой устройства, связанного с зарядом. Сделайте мышечные изображения через 24, 48 и 72 часа после этапа L4.

Проводите анализ изображений и подготовку фигур с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Определения баллов и уровней повреждения мышц показаны на рисунке 1, для которого критерии приведены следующим образом: 3 балла за отсутствующие мышечные волокна; 2 балла за разрыв или повреждение мышечных волокон; 1 балл за согнутые мышечные волокна; 0 баллов за здоровые мышечные волокна.

Результаты

Рисунок 1: Соответствующие показатели некроза мышц у C. elegans , вызванного инфекцией Aeromonas . Критерии некроза мышц и соответствующие оценки следующие: 3 балла за отс...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шейкер-инкубатор	ЙИХ ДЕР	LM-570R	Инкубация бактерий
K₂HPO₄	Дж.Т. Бейкер	MP021519455	Подготовка на основе культурных средств
KH₂PO₄	Дж.Т. Бейкер	3246-05	Подготовка на основе культурных средств
Na₂HPO₄	Дж.Т. Бейкер	MP021914405	Подготовка на основе культурных средств
NaCl	SIGMA	31434	Подготовка на основе культурных средств
MgSO₄	SIGMA	M7506	Подготовка на основе культурных средств
Агар	Difco	214530	Подготовка на основе культурных средств
CaCl₂	SIGMA	C1016	Подготовка на основе культурных средств
Холестерин	SIGMA	C8503	Подготовка на основе культурных средств
Этанол	SIGMA	32205	Подготовка на основе культурных средств
KOH	SIGMA	P5958	Подготовка на основе культурных средств
Пластина Петри диаметром 6 см	ALPHA PLUS	46	Подготовка тарелки агара
Бактериальный пептон	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Подготовка на основе культурных средств
Экстракт дрожжей	SIGMA	92144	Подготовка на основе культурных средств
Лимонная кислота•H₂O	SIGMA	C1909	Подготовка на основе культурных средств
Трикалий цитрат•H₂O	SIGMA	104956	Подготовка на основе культурных средств
FudR	SIGMA	1271008	Подготовка на основе культурных средств
Динатриевый EDTA	SIGMA	E1644	Подготовка на основе культурных средств
FeSO₄·7H₂O	SIGMA	215422	Подготовка на основе культурных средств
MnCl₂·4H₂O	SIGMA	221279	Подготовка на основе культурных средств
ZnSO₄·7H₂O	SIGMA	204986	Подготовка на основе культурных средств
CuSO₄·5H₂O	SIGMA	C8027	Подготовка на основе культурных средств
Триптон	SIGMA	16922	Подготовка на основе культурных средств
Микроскопическая система	Nikon	Эклипаза Ti инвертирована	Микроскопическая визуализация
Научная CCD-камера	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Микроскопическая визуализация