Стабилизация бактериальных гидрогелевых паттернов, опосредованная волокном Curli

Аннотация

Источник: Spiesz, E. M. и др., Трёхмерное накопление инженерных биопленок с помощью биопринтера самостоятельно. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется метод сравнения 3D-печатных альгинатных узоров, содержащих либо контрольные, либо генетически модифицированные бактериальные штаммы. Тестовая формация при индукции образует волокна curli, которые усиливают структуру гидрогеля из альгината. После обработки кальцие-хелатирующего раствора остаётся нетронутой только тестовая схема, что подчёркивает стабилизирующий эффект образования волокон кудрявых.

Протокол

1. 3D процесс печати

1. Установите и откройте программное обеспечение для 3D-печати (Таблица материалов) на компьютере. Подключите 3D-принтер к компьютеру. Переместите печатающую головку в домашнее положение, нажав кнопку Home для осей X, Y и Z.
2. Для каждого отпечатка размещайте подготовленную печатную подложку в определённом месте на печатной площадке.
3. Откалибруйте высоту печатающей головки по оси Z.
   1. Поднимите печатающую головку на высоту 22 мм при ручном управлении, чтобы она не столкнулась с краем чашки Петри при переходе в нужное положение. Разместите печатающую головку поверх пластины и опустите её, пока кончик пипетки не соприкоснётся с печатающей поверхностью. Назначим эту позицию по оси Z как Z1 (высоту печатающей поверхности).
   2. Поднимите печатающую головку и переместите её за пределы пластины вручную по осям X, Y и Z. Если рабочее расстояние между печатающей головкой и поверхностью пластины определено как Z2, введите Z1 + Z2 в программу печати как Z-значение во время печати.
4. Запрограммируйте форму печати с помощью самостоятельно разработанного метода, определяемого точками-точками, согласно желаемой траектории.
   1. Если желаемая траектория — прямая, определите только начальную и конечную точки. Добавление дополнительных точек на изогнутые линии приведёт к более гладким кривым. Вручную перемещайте печатающую головку в каждую точку последовательно и записывайте координаты этих точек по порядку. Введите все эти координаты, а также скорость перемещения печатающей головки для каждого напечатанного сегмента в редактор G-кода.
5. Как до, так и после печати, поднимите печатающую головку на расстояние выше края пластины (20 мм) и выйдите прямо из области пластины. Сохраняйте эту программу в виде файла G-кода и загружайте напрямую для последующих печатей, при этом переизмеряя высоту оси Z для каждого нового печатного субстрата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу 1 для примера G-кода для печати квадрата.
6. Загрузите заранее запрограммированный файл G-кода. Откройте редактор G-code в программном обеспечении и введите команды для печати нужной формы. В каждой командной строке положение печатающей головки может изменяться по осям X, Y и/или Z. Вводите значение Z на всех этапах печати как Z1 + Z2 (высота печатной поверхности + рабочее расстояние).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость движения также регулируется; 9 000 мм/мин — подходящее значение для типичных скоростей печати.
7. Загрузите жидкие био-чернила в шприц и закрепите их в насосе(ях) 3D-принтера.
8. Напечатайте био-чернила на печатной подложке, нажав кнопку «Печать».
9. Во время печати полностью управляйте движением печатающей головки с помощью программного обеспечения. Запустите шприцовый насос вручную до того, как головка соприкоснётся с печатающей поверхностью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Координация насоса для шприца и принтера определяется эмпирически в зависимости от скорости экструзии, скорости перемещения головки к первой точке печати и начального положения печатающей головки. Если начальное положение печатающей головки составляет 20 мм, скорость печатающей головки 9000 мм/мин и экструзия 0,1 мл/ч, сразу после начала печати запускайте насос для шприца. Если скорость экструзии изменена с 0,1 мл/ч до 0,3 мл/ч, подождите 2−3 секунды, чтобы запустить насос шприца после начала печати.
10. Остановите насос для шприца, как только печатающая головка прибудет в последний момент печати. Остановите насос для шприца до того, как печатающая головка поднимется в конце процесса, иначе избыток био-краски упадёт на печатную подложку и уменьшит разрешение печати.
11. Для построения 3D-структур управляйте всеми движениями печатающей головки в редакторе G-кода. Введите высоту печати первого слоя. Увеличьте Z-значение в G-коде на 0,2 миллиметра для второго слоя, чтобы увеличить высоту печати. Затем увеличивайте Z-значение на 0,1 миллиметра при переходе на более высокий слой. Не двигайте пластину во время печати.
12. Чтобы измерить ширину и высоту напечатанного гидрогеля, используйте стальную линейку, размещённую под или рядом с образцом.

2. Выращивание и тестирование эффективности производства биопленок с помощью E. coli

1. Инкубировать напечатанные образцы при комнатной температуре в течение 3−6 дней для получения компонентов биопленки (волокон curli). Сфотографируйте пластины с помощью камеры или люминесцентного сканера.
2. Для растворения матрицы альгината добавьте 20 мл раствора цитрата натрия с концентрацией 0,5 м (pH = 7 с учетом NaOH) в печатные подложки и инкубировать 2 часа при 30 об/мин встряхиванием при комнатной температуре. Сбросьте жидкость и снова снимите пластины, чтобы сравнить с изображениями пластин до обработки цитратом.

Таблица 1: Процесс программирования и объяснения G-кода для печати квадрата.

Команды G-кода	Задачи
G1 Z20 F9000	Поднимите ось Z на высоту 20 мм со скоростью движения 9000 мм/мин.
G1 X95 Y65 F9000	Переходите к стартовой точке первой линии со скоростью движения 9 000 мм/мин.
G1 Z6 F9000	Двигайтесь вниз в направлении Z до правильного (здесь Z = 6 мм) расстояния печати.
G1 X95 Y105 F300	Конечная точка первой строки и начальная точка второй строки.
G1 X135 Y105	Конечная точка второй линии и начальная точка третьей линии.
G1 X135 Y65	Конечная точка третьей линии и начальная точка четвёртой.
G1 X95 Y65	Конечная точка четвёртой линии и начальная точка первой строки; Образуется квадрат.
G1 Z20 F9000	Поднимите ось Z на высоту 20 мм при скорости 9 000 мм/мин.
G1 X55 Y40 F9000	Переместитесь к координате (55, 40) вне диапазона чашки Петри.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Порошок бульона LB	Сигма-Олдрич	L3022
Орбитальный встряхивающий	VWR	89032-092	Модель 3500
Чашка Петри	VWR	25384-326	150 x 15 мм
Рамноз	Сигма-Олдрич	83650
Кремниевые трубки	VWR	ДЕНЕ 3100103/25
Шприцовый насос	ProSense B.V.	NE-300
Альгинат натрия	Сигма-Олдрич	W201502
Монобазовый цитрат натрия	Сигма-Олдрич	71498
Гидрооксид натрия	VWR	28244.295