1. Установка микроскопа и таймлапс-обработка
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный здесь протокол был разработан для инвертированного широкопольного микроскопа с автофокусом, масляным объективом PH3 100X/1,30 NA, моторизованной ступенью X, Y, камерой sCMOS, источником света, фильтрами для белоков зелёного флуоресцентного, красно-флуоресцентного или жёлтого флуоресцентного белка, а также инкубационной камеры с контролируемой температурой. Эта камера защищает клетки от света и при постоянной температуре.
- Перед началом микроскопии нагрейте инкубационную камеру и микроскоп до 32 °C в течение ~1–2 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от установки микроскопа, нагрев может занять больше времени. Предварительный нагрев необходим для снижения дрейфа и стабилизации системы управления автофокусом. - Включите микроскоп и запустите программное обеспечение управления микроскопом. Выберите правильный объектив, а также нужные зеркала и фильтры для получения изображений фазового контраста, а также изображений белоков с зелёным флуоресцентным и красным флуоресцентным или жёлтым флуоресцентным изображением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп обычно поставляется с предпочтительным программным обеспечением для управления микроскопом и получения изображений. Здесь коммерчески доступное программное обеспечение (см. Таблицу материалов) использовалось для управления микроскопом и получением изображений. - Добавьте каплю высококачественного погружного масла на объективную линзу и на дно образца, предварительно инкубированного при 32 °C. Разместите объектив в минимально возможном положении Z, чтобы не повредить его при размещении образца на стадии микроскопа. Поместите металлическую раму с образцом на ступень микроскопа, с «отверстием» к объективу. Надёжно закрепите образец в держателе сцены.
- Сосредоточьтесь на ячейках, приблизив ступень в направлении Z к цели. Двигайте ступень медленно, когда масло падает на нижнюю сторону образца, и объектив контактирует с ним. Двигайте ступень в направлении X/Y, пока в области обзора не появятся несколько отдельных ячеек, когда ячейки находятся в фокальной плоскости. Убедитесь, что в области обзора находится хотя бы одна флуоресцентная микросфера, чтобы позже выровнять полученные изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: При оптимальных условиях плотность ячеек достигается 15–30 ячеек на область обзора (2 048 x 2 048 пикселей или 133,1 x 133,1 мкм). - Откройте мастер многомерного приобретения в программном обеспечении управления микроскопом, чтобы настроить эксперимент с таймлапсом, который позволяет микроскопу получать изображения с разными длинами волн и позициями ступеней при необходимости.
- В главной вкладке активируйте таймлапс и несколько длин волн. Дополнительные вкладки появятся слева в окне.
- Нажмите на вкладку «Сохранение » и выберите «Каталог», чтобы выбрать пустую папку на жёстком диске компьютера и сохранить полученные изображения. Активируйте имя базы Increment, если файл существует , чтобы убедиться, что последовательные наборы данных не перезаписывают предыдущие. Затем дайте эксперименту название с датой и названием сорта или названием эксперимента.
- Нажмите на вкладку «Таймлапс », чтобы настроить параметры таймлапса. Установите длительность на 24 часа, а интервал времени — на 20 минут. Количество очков времени изменится автоматически.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный временной интервал зависит от эксперимента и анализируемой функции клетки. Частое получение изображений может вызвать фотоотбеливание. Таким образом, необходимо эмпирически найти компромисс между временным разрешением и фотоотбеливанием. При удвоении 4–6 часов изображения можно легко получить с интервалом в 5 минут (или даже с меньшими интервалами, если хотите) для фазово-контрастной микроскопии. Если требуется флуоресцентная микроскопия в течение 24 часов, изображения следует делать с интервалом примерно 15–30 минут. - Нажмите на вкладку Wavelengths . Выберите количество длин волн для каждого изображения в каждую точку времени, изменив число.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой длины волны слевая часть мастера многомерного приобретения появляется новая вкладка, и длины волн будут набираться в порядке сверху вниз. Для каждой длины волны настройки приобретения можно изменять отдельно. - Нажмите на первую вкладку длины волны сверху. Выберите «Фазовый контраст» в выпадающем списке «Освещение ». Выберите 100 мс для Exposure и выберите Every Time Point в выпадающем списке Get . Отключите Auto Expose , выбрав Never в выпадающем списке.
- Повторите шаг 3.5.5 для каждой длины волны, которую нужно получить в каждой точке времени. Для экспериментальной установки и флуоресцентно маркированных белков, описанных здесь, используйте следующие параметры для экспозиции: 250 мс для белков mCherry fusion, 200 мс для YFP (жёлтый флуоресцентный белок) и 1 000 мс для GFP (зелёный флуоресцентный белок).
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные настройки освещения для каждого штамма и флуоресцентного белка должны быть определены заранее, изменяя интенсивность лампы и время получения изображения для каждой длины волны. Слишком долгие сроки получения изображения усиливают фототоксический эффект и в конечном итоге приведут к остановке роста и гибели клеток. Поэтому следует достичь компромисса между качеством изображения и жизнеспособностью клеток. - Получите изображения с нескольких позиций стадии, чтобы увеличить количество ячеек, зафиксированных в одном эксперименте.
- Чтобы получить изображения с нескольких позиций уровня, активируйте Multiple Stage Positions во вкладке Main . Затем нажмите на вкладку «Сцена » и нажмите кнопку «Живой эфир», чтобы посмотреть поле зрения.
- Двигайте сцену в направлении X/Y, пока область интереса (ROI) не появится в поле зрения. Сохраните координаты X- и Y, нажав «+» во вкладке Stage . Переместите уровень снова в направлении X/Y, пока не найдёте новый ROI, и снова сохраняйте координаты, нажав «+». Продолжайте, пока не соберётся нужное количество регионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: При получении флуоресцентного изображения убедитесь, что интересующие области (ROI) не расположены слишком близко друг к другу, чтобы минимизировать фототоксичность.
- Ещё раз проверьте, что ячейки в фокусе, кликнув на разные сохранённые X- и Y позиции, и запустив аппаратный автофокус, нажав AFC hold , чтобы сохранить сохраненную Z-позицию постоянной в течение эксперимента.
- Запустите таймлапс-записи в программном обеспечении управления микроскопом, нажав Acquire в мастере многомерного приобретения .
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой полученной длины волны появляется одно окно, а также дополнительное окно, показывающее количество полученных точек времени и время до следующего получения изображения. - Проверьте, остаются ли клетки в фокусе после первых нескольких точек таймлапс-записей, чтобы максимизировать качество изображений и при необходимости перефокусироваться.