Временная визуализация хищников Bdellovibrio bacteriovorus на кишечную палочку

Аннотация

Источник: Makowski, Ł., и др. Живоклеточная визуализация жизненного цикла бактериального хищника Bdellovibrio bacteriovorus с использованием временной флуоресцентной микроскопии. J. Vis. Exp . (2020)

В этом видео демонстрируется временная флуоресцентная визуализация Bdellovibrio bacteriovorus , охотящегося на обездвиженный E. coli под агарозной подушечкой, что позволяет в реальном времени визуализировать внутриклеточную репликацию и высвобождение потомства для изучения бактериального хищничества и взаимодействия хозяина с патогеном.

Протокол

1. Проведение временной флуоресцентной микроскопии

1. Поместите 35-мм антенну в держатель чашки Петри так, чтобы она не двигалась во время эксперимента. Налейте одну каплю погружного масла (показатель преломления 1,518) на объектив и дно антенны диаметром 35 мм.
2. Закрепите держатель на сцене перевёрнутого микроскопа в камере микроскопа.
3. Настройте настройки в программном обеспечении управления микроскопом для сбора нескольких изображений в разных позициях со временем.
   1. Установите увеличение (100x) и полихромную линзу (GFP (зелёный флуоресцентный белок)/mCherry). Используя окуляр и яркое поле (BF), найдите фокальную плоскость и откройте менеджер списка точек.
   2. Выберите как минимум 10 интересующих позиций, переместив ступень и сохраняя координаты каждой позиции в программном обеспечении микроскопа, нажав кнопку «Отметить точку ». Избегайте расположения близко друг к другу позиций, чтобы предотвратить фотоотбеливание и фототоксичность. Поверните клапан камеры от окуляра к монитору и откалибруйте каждую точку, установив фокальную плоскость и нажав кнопку «Заменить точку » в менеджере списка точек.
   3. Откройте конструктор эксперимента и задайте все параметры эксперимента в каждой вкладке следующим образом:
      1. Снимите отметку с коробки Z-stacking .
      2. Выберите люминесцентные каналы и установите оптимальные настройки освещения. Здесь использовались следующие настройки: для канала mCherry — наборы фильтров mCherry (EX575/25; EM625/45), интенсивность 50% и время экспозиции 200 мс; для канала GFP — набор фильтров GFP (EX475/28; EM525/48), интенсивность 50% и 80 мс; а для BF-изображений — POL-канал, 5% интенсивности и 50 мс.
      3. Выберите интервалы между получением изображений и общим временем эксперимента. Здесь в течение 10 часов эксперимента проводились интервалы с интервалом в 5 минут.
      4. Включите поддержание фокуса для выбранных позиций (для используемой здесь системы, помечав Keep focus галочкой UltimateFocus ).
      5. Выберите папку с данными, в которую должны сохраняться файлы изображений автоматически.
      6. Перепроверьте все настройки в программном управлении микроскопом, затем начните эксперимент с таймлапсом.
4. После первого часа эксперимента проверьте, что все позиции сцены остаются в фокусе. При необходимости корректируйте фокус в промежутках между получением изображений.
5. Когда эксперимент с таймлапсом завершится, снимите чашку Петри и используйте 35-мм антенну с агарозной подушечкой согласно протоколу биобезопасности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все подшаги после шага 1.2 специфичны для пользователей DeltaVision Elite. Исследователям, использующим другие системы, необходимо корректировать настройки в зависимости от отдельных систем.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сертифицированная молекулярная биология Агароз	BIO-RAD	161-3100	Агароза с низкой флуоресценцией для агарозной площадки
Фиджи	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Пакет для обработки изображений с открытым исходным кодом
Стеклянная чаша с дном 35 мм	ibidi	81218-200	Непокрытое стекло
Микроскоп	GE	DeltaVision Elite	Microtiter Stage, лазерный модуль ultimate focus, камера DV Elite CoolSnap HQ2, SSI assembly FP DV, комплект obj. Oly 100x масло 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, env ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
Запусти SoftWoRx	GE		Программное обеспечение для визуализации, поставляемое производителем