Визуализация распределения бактериального белка в трёх измерениях с помощью флуоресцентной визуализации

Аннотация

Источник: Bratton, B. P. и др., Трёхмерная визуализация бактериальных клеток для точного представления клеток и точной локализации белка. J. Vis. Exp .(2019)

В этом видео демонстрируется метод получения и анализа трёхмерных флуоресцентных изображений бактериальных клеток для изучения организации белков на уровне одной клетки.

Протокол

1. Визуализация

1. Вставьте герметичный стекло на микроскоп и дайте ему постоять 5 минут, чтобы уравновесить температуру с окружающей средой. Комната микроскопа может находиться при другой температуре, чем комната для подготовки образцов.
2. Возьмите флуоресцентный z-стек образца образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Z-стек должен полностью покрывать образец с интервалом z, меньше глубины резкости. Для объектива 1,45 NA 100x и клетки E . coli толщиной ~1 мкм хорошо работают 40 шагов при 100 нм на шаг. Для больших клеток или клеток, которые не лежат идеально ровно на поверхности, может потребоваться 50 и более шагов. Включите достаточно шагов и убедитесь, что образец полностью размыт сверху и снизу.
   1. Используйте программное обеспечение, связанное с микроскопом (см. таблицу материалов), чтобы управлять микроскопом.
   2. Фокусируйтесь на середине клетки с помощью фокусных колёс микроскопа. В разделе ND acquisition поставьте галочку Z, чтобы взять z-стек. Нажмите кнопку «Домой», чтобы установить середину ячейки в качестве отправной точки. Установите размер шага на 0,1 мкм и диапазон на 4 мкм. Убедитесь, что устройство Z установлено на пьезо-стадию.
   3. Установите люминесцентные каналы под окном лямбда на настройки для флуоресцентных молекул, которые снимаются. В этом эксперименте использовались GFP и mCherry.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмём дополнительный z-стек с тем же размером шага и диапазоном во втором цветном канале, если требуется 3D-распределение дополнительного люминесцентного канала. В этом эксперименте для определения формы клетки использовался цитоплазматический mCherry, а MreB-GFP — в качестве второго цветного канала.
   4. Убедитесь, что Order of Experiment установлен на lambda (серия z), чтобы он принимал полный z-стек в каждом цветном канале перед переключением.
   5. Нажмите «Запустить сейчас», чтобы начать получение изображений и сохранить файл, когда один или оба z-стека будут завершены.
   6. Переместитесь в новую область на площадке и повторите шаги 1.2.2–1.2.5.

2. Реконструкция клеток

1. Обрезайте отдельные ячейки и сохраняйте изображения в виде стекированного tiff-файла, чтобы в файле была только одна ячейка. Убедитесь, что эта ячейка хорошо изолирована от любых других ячеек (то есть примерно в 5 раз превышает полполширину пол-максимума функции размытия в xy).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать с помощью свободно доступного программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов).
   1. Нарисуйте блок вокруг отдельной ячейки и повторите её дважды, по одному разу для каждого канала. Убедитесь, что дублирующий гиперстек отмечен, и измените канал на 1 или 2, убедившись, что срезы включают весь z-стек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если визуализировать только форму клеток, а не дополнительный флуоресцентный белок, будет присутствовать только один канал.
   2. Когда оба стека станут доступны, перейдите в раздел Images | Стеки | Инструменты | Сначала объединяйте изображения с белковым каналом, а затем с формным каналом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агарозе	sigma-Aldrich	A9539
Ватная палочка	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	Использовал VaLaP
Обложные слипы	VWR	16004-302
Фиджи	ImageJ	https://fiji.sc	Используется для CRO-ячейки
Lanolin	Сигма-Олдрич	L7387	Соединяйте с парафином и вазелином для получения VaLaP
Среда роста LB	BD Difco	DF0446173
M63 medium	Биологическая служба США	M1015
MATLAB	Mathworks		Нужно было запустить вперёд скрипты свертки
Микроскопические стекли	Фишер	12-550-133
Элементы NIS	Нкон
Парафин	Сигма-Олдрич	327212
Вазелин	Эквивалент	49035-038-27
Сцена Piezo z	Nikon	77011589
Наконечники пипеты -p200	USA Scientific	1111-0730
Наконечники пипеты — p10	USA Scientific	1111-3730