Количественное определение кишечной бактериальной нагрузки у данио-рерио, инфицированных холерой Vibrio

Аннотация

Источник: Наг, Д. и др. Количественная оценка колонизации и диареи Vibrio cholerae в модели взрослой данио-рерио. J. Vis. Exp . (2018)

В этом видео демонстрируется протокол количественной оценки кишечной бактериальной нагрузки у взрослых данио-рерио, инфицированных антибиотикорезистентным штаммом Vibrio cholerae. После эвтаназии и вскрытия кишечник изолируется, гомогенизируется стеклянными бусинами и обрабатывается для высвобождения бактерий. Полученный гомогенат наносится на селективную среду, а синие колонии, экспрессирующие β-галактозидазу, подсчитываются для оценки бактериальной нагрузки.

Протокол

1. Определение уровней колонизации кишечника

ПРИМЕЧАНИЕ: Колонизация кишечника — самая полезная метрика в модели данио-рерио, так как её можно использовать для сравнения относительной приспособленности различных штаммов V. cholerae или влияния мутаций или нокаутов генов.

1. Эвтаназия

1. Когда эксперимент достигнет желаемой цели, возьмите образец воды инфекции (обычно достаточно 15 мл), чтобы учесть количество выделяемых бактерий и измерять диарею (например, анализ на муцин, содержание белка и/или передозирование), если это необходимо.

2. Вылить оставшуюся воду через рыболовную сеть (чтобы собрать рыбу) в отбеливатель, чтобы убить V. cholerae в воде.

3. Поместите рыбу в стакан с инфекционной водой и 336 мкг/мл этил-3-аминобензоата метансульфоната (трикаина) и инкубировать рыбу в этом растворе трикаина в течение 20 минут при RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатые ткани были стерилизованы 10% раствором отбеливателя.

2. Вскрытие

1. Приготовление рыбы

1. Вычерпите рыбу из раствора трикаина одноразовой пластиковой ложкой и положите её на поверхность для вскрытия.

2. Поставьте рыбу так, чтобы вентральная сторона была обращена вверх, и приколоть её через нижнюю челюсть, при этом тупой конец булавки был наклонен от центра тела. Поставьте ещё одну булавку чуть позади ануса, также наклонённую от тела.

2. Воздействие кишечника

1. Протрить вентральную поверхность рыбы салфеткой без ворса, обмакнутой в 70% этанола.

2. Стерилизуйте скальпель и ножницы Ванна, окунув их в 70% этанола и поджига.

3. Сделайте небольшой разрез вдоль живота прямо под кожей, проникнув в чешуйки и используя скальпель. Будьте осторожны, чтобы не резать слишком глубоко, так как кишечник находится прямо под кожей.

4. С помощью ножниц аккуратно растягивайте разрез вдоль длины тела, не разрезая глубже уровня кожи и избегая ануса.

5. Сделайте два боковых разреза ножницами к голове рыбы, чтобы сделать разрез открытым.

6. Приколоть кожу с обеих сторон боковых разрезов к поверхности рассечения, наклоняя штифты наружу, в сторону от тела.

ПРИМЕЧАНИЕ: Кончики штифтов ранее стерилизовывали их спиртом.

3. Удаление кишечника

ПРИМЕЧАНИЕ: Кишечник должен быть виден в виде бледной, очень тонкой трубки поверх других органов.

1. Простерилизуйте щипцы пламенем, а затем с помощью них удалите весь кишечник (обычно длиной 12–15 мм). Поместите кишечник в трубку для гомогенизации с стеклянными шариками (см. шаги 1.3.1–1.3.2) и 1 мл 1x PBS или LB на льду.

3. Гомогенизация

1. Заранее подготовьте трубки для гомогенизации, наливая ~1,5 г стеклянных шариков толщиной 1 мм в трубки с винтовой крышкой объёмом 2 мл (заполните их примерно наполовину), а затем стерилизуйте их автоклавированием.

2. Добавьте 1 мл стерильного LB или 1x PBS.

3. После добавления кишечника данио-рерио (шаг 1.2.3.1) в трубки, очень плотно прикрутите крышки, а затем закрепите трубки в вихрьевой гомогенизаторе.

4. Гомогенизуйте образцы на 1 минуту на максимальной мощности, затем охладите их на льду 1–2 минуты. Повторите этот цикл гомогенизации ещё раз для полной гомогенизации. Примечание: также подойдёт несколько альтернативных методов гомогенизации.

4. Количественная оценка уровней колонизации кишечника

1. Подготовьте пробирки (либо маленькие стеклянные, либо микроцентрифугные пробирки объемом 1,5 мл) для последовательного разбавления гомогената, добавив в каждую пробирку 900 мкл LB или 1x PBS. Для каждой рыбы подготовьте 5–6 трубок и сделайте 10-кратное последовательное разбавление гомогената кишечника, добавляя 100 мкл гомогената в первую трубку, вставляя его в вихрь для смешивания, а затем добавляя 100 мкл из первой трубки во вторую.

2. Повторяйте эту процедуру, пока все разбавления не будут готовы.

3. Пластинка 100–200 мкл каждого разбавления на LB-агарных пластинах, содержащих 100 мкг/мл стрептомицина (при использовании штрептомицинорезистентных штаммов) и 40 мкг/мл X-гал (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-галактопиранозид). Инкубировать тарелки при 30 °C в течение 16–18 часов.

4. После ночной инкубации подсчитайте колонии V. cholerae на пластинах, используя автоматический счётчик колоний или вручную; Полезно отмечать подсчитанные колонии маркером.

5. Определите CFU на кишечник рыбы, умножив количество пластин на коэффициент разбавления суспензии, учитывая объём, который был покрыт.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инструмент
Шейкер-инкубатор	New Brunswick Scientific, Эдисон, Нью-Джерси	Excella E25
Инкубатор	NUAIRE, Плимут, Миннесота	Auto Flow
Спектрофотометр	Термо, Уолтем, Массачусетс	Geaesys 6
Вихревой гомогенизатор	Minibeadbeater24	112011
Весовая машина	Охаус, Колумбия, Мэриленд	Adventurer Pro
Мешалка для нагрева	Корнинг, Корнинг, Нью-Йорк	PC-420D
Горелка
Автоматический счётчик колоний	REVSCI	120417B
Материалы
Стеклянные стаканы по 400 мл	Пирекс
Перфорированные крышки	Держатель для микронаконечника с отверстиями от коробки
Одноразовые пластиковые ложки	Office Depot, Бока-Ратон, Флорида	D15-25-7008
Система аквариумов	Aquaneering, Сан-Диего, Калифорния
Очиститель воды RO	Aqua FX	TK001
Рыболовная сеть	Марина
Корм для рыб	Тетра-плавник
Солёные креветки	Красный клейм джунглей	O.S.I. PRO 80
Пенопластовая плита
Кегли
Скальпели	Fine Scientific Tools, Фостер-Сити, Калифорния	10000-10
Щипцы	Fine Scientific Tools, Фостер-Сити, Калифорния	11223-20
Ножницы Ванна	Fine Scientific Tools, Фостер-Сити, Калифорния	15000-11
Трубки с винтовыми крышками объемом 2 мл	Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир	02-681-375
Стеклянные бусины толщиной 1 мм	Bio Spec	11079110
Стеклянные бусины для намазывания	Сигма, Сент-Луис, Миссури	18406-500G
Пластина Петри	Фишер Бранд, Хэмптон, Нью-Гэмпшир	FB0875713
Центрифугная трубка объемом 1,5 мл	Мидси, Вэлли-Парк, Миссури	AVSS1700
Центрифугная трубка объемом 50 мл	Корнинг Фэлкон, Корнинг, Нью-Йорк	352098
Пробирки	Пирекс	9820
Стеклянная пипетка	Фишер Бранд, Хэмптон, Нью-Гэмпшир	13675K
Микропипетки	Sartorius Biohit, Гёттинген, Германия	m1000/m200/m20
Советы	Genesee Scientific, Сан-Диего, Калифорния	24-150RS/24-412
Химикаты
Instant Ocean соли
Фосфатный буферный физиологический раствор	VWR Life Science, Раднор, Пенсильвания	K813-500 мл
Трикаин (этил3-аминобензоатная метансульфонатная соль	Сигма, Сент-Луис, Миссури	A5040
LB средний материал
NaCl	Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир	BP358-212
Агар	BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния	214010
TCBS Agar	BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния	265020
DCLS Agar	Сигма, Сент-Луис, Миссури	70135-500 г
Программное обеспечение
Microsoft Office
Призма 5