Колонизация кишечника и индукция диареи с помощью Vibrio cholerae у взрослых данио-рерио.

Аннотация

Источник: Наг, Д., et.al. Количественная оценка колонизации и диареи Vibrio cholerae в модели взрослой данио-рерио. J. Vis. Exp . (2018)

В этом видео демонстрируется прививка взрослой данио-рерио патогенным штаммом Vibrio cholerae для изучения колонизации кишечника и исходов заболеваний. Показано, как бактериальные токсины нарушают целостность кишечника, что приводит к протеканию жидкости, выделению слизи и водянистой диарее до того, как рыбы готовятся к дальнейшему анализу.

Протокол

1. Инокуляция данио-рерио, погружением
   ПРИМЕЧАНИЕ: Такой способ заражения напоминает естественный ход инфекции.
   1. Приготовление Vibrio cholerae
      1. Инокуляция 5 мл лизогенного бульона (LB) изолированной колонией V. cholerae из пластины LB и инкубировать при 37 °C с встряхиванием (180 об/мин) в течение 6–8 часов (ночная культура).
      2. Инокуляция 25 мл свежего автоклава LB medium в конической колбе объёмом 250 мл с 50 мкл вышеуказанной культуры за ночь. Инкубировать его 16–18 часов при 37 °C с встряхиванием (150 об/мин).
      3. Считывайте оптическую плотность при 600 нм (_{OD 600}) при 1/10 разбавления ночной культуры, чтобы оценить количество бактерий на мл (_{OD 600} = 1 равно ~10⁹ CFU/mL).
      4. Собирайте клетки центрифугированием при 6 000 г в течение 10 минут. Удалите среду пипеткой или вылейте в дезинфицирующий раствор. Суспензировать клетки в стерильной PBS до нужной концентрации, обычно от 1 x 10^до 1 x 10¹⁰ на мл PBS.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы называем аутоклавированную воду с обратным осмосом, содержащую морские соли 60 мг/л, стерильной инфекционной водой.
   2. Инокуляция и инкубация
      1. Поместите четырёх или пяти данио-рериов в стакан объёмом 400 мл с 200 мл стерильной инфекционной воды.
      2. Добавьте 1 мл V. cholerae , чтобы получить желаемую концентрацию инфекции (обычно 5 x 10⁴ –5 x 10⁷ CFU/mL) в 200 мл инфекционной воды.
      3. Накройте колбу перфорированной крышкой, чтобы рыба не выпрыгнула наружу; верхняя часть коробки с насадками на 200 мкл хорошо подходит для этого.
      4. Промаркируйте каждую стакан и поместите их в стеклянный инкубатор с температурой 28 °C на время эксперимента.
   3. Процедура переходного воздействия
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кратковременное воздействие на V. cholerae (обычно 6 часов) с последующим удалением инокуляционных бактерий полезно для изучения передачи и более точной количественной оценки выделяемых бактерий.
      1. После 6 часов экспозиции вылейте воду из стакана через рыболовную сетку, чтобы собрать рыбу. Выбросьте заражённую воду в контейнер с отбеливателем, чтобы убить V. cholerae.
      2. Поместите выброшенную рыбу в стакан с 200 мл стерильной инфекционной воды. Дайте рыбе поплавать в этой чистой воде 5 минут, чтобы удалить поверхностные бактерии.
      3. Повторите процедуру с сеткой и поместите рыбу в новый стакан с 200 мл стерильной инфекционной воды. Держите рыбу в этом стакане на время эксперимента.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инструмент
Инкубатор	NUAIRE, Плимут, Миннесота	Auto Flow
Материалы
Стеклянные стаканы по 400 мл	Пирекс
Перфорированные крышки	Держатель для микронаконечника с отверстиями от коробки
Система аквариумов	Aquaneering, Сан-Диего, Калифорния
Очиститель воды RO	Aqua FX	TK001
Рыболовная сеть	Марина
Корм для рыб	Тетра-плавник
Пластина Петри	Фишер Бранд, Хэмптон, Нью-Гэмпшир	FB0875713
Центрифугная трубка объемом 1,5 мл	Мидси, Вэлли-Парк, Миссури	AVSS1700
Пробирки	Пирекс	9820
Микропипетки	Sartorius Biohit, Гёттинген, Германия	m1000/m200/m20
Советы	Genesee Scientific, Сан-Диего, Калифорния	24-150RS/24-412
LB средний материал
Trypton	BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния	211705
Экстракт дрожжей	BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния	212750
NaCl	Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир	BP358-212
Агар	BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния	214010