Оценка проницаемости кишечника у C. elegans после воздействия бактерий

Аннотация

Источник: Le, T. A. N . и др., Измерение влияния бактерий и химических веществ на кишечную проницаемость Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp . (2019)

В этом видео демонстрируется флуоресцентный анализ для количественной оценки кишечной проницаемости у C. elegans, подвергшихся воздействию Pseudomonas aeruginosa. По сравнению с контролем, получавшими Escherichia coli, у червей, обработанных патогенами, наблюдается повышенная утечка флюорофоров в полость тела, что указывает на повреждение эпителиального барьера.

Протокол

1. Подготовка пластин для роста нематод (NGM) для тестирования влияния различных бактерий на кишечную проницаемость Caenorhabditis elegans (C. elegans)

1. Положите 1,25 г пептона, 1,5 г NaCl, 8,5 г агара, магнитную мешалку и 487,5 мл дистиллированной воды в стеклянную бутылку объёмом 500 мл.
2. Хорошо перемешайте смесь, подготовьте её на автоклаве 15 минут при 121 °C и охладите до 55 °C в водяной бане в течение 30 минут.
3. Вынимите среду из водяной бани, добавьте компоненты (0,5 мл 1 M CaCl₂, 0,5 мл холестерина, 0,5 мл_{MgSO 4}, 12,5 мл KPO₄) в NGM и хорошо перемешайте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все отдельные компоненты должны быть автоклавированы, кроме холестерина (растворённого в абсолютном этаноле), и каждый экспериментальный этап должен проводиться на чистом столе.
4. Распределите по 20 мл NGM в каждую чашу Петри размером 90 x 15 мм и дайте агару затвердеть на чистом столе при комнатной температуре (примерно 20 °C). Пластины NGM могут храниться до одного месяца при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Были подготовлены пластины NGM, используемые для окрашивания FITC-декстраном (флуоресцеин изотиоцианатом-декстраном). 10 мл NGM распределялось на каждую чашку Петри размером 60 x 15 мм и давалось затвердеть на чистом столе при комнатной температуре (примерно 20 °C).
5. Удалите бактериальную культуру из холодильника при температуре 4 °C и тщательно обработайте её вихрем перед тем, как нанести её на пластины NGM.
6. Добавьте в общей сложности 800 мкл бактериальной культуры в каждую свежую пластину NGM и дайте тарелкам высохнуть в инкубаторе при температуре 20 °C на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для первого эксперимента (рисунок 1) были подготовлены две пластины NGM с E. coli OP50, одна пластина NGM с P. aeruginosa PAO1 и одна пластина NGM с E. faecalis KCTC3206. Для второго эксперимента (рисунок 2) были подготовлены две пластины NGM с живой E. coli OP50, одна пластина NGM с живой P. aeruginosa PAO1 и одна пластина NGM с термоинактивированной P. aeruginosa PAO1.

3. Подготовка возрастно-синхронизированных C. elegans

1. Выращивайте червей на твёрдой пластине NGM и кормите их E. coli OP50, пока не достигнут желаемой популяции.
2. Синхронизируйте яйца с помощью метода откладки по времени или обработки раствором отбеливателя

4. Лечение бактерий и кормление FITC-декстраном

1. Инкубировать синхронизированные по возрасту яйца при 20 °C в течение 64 часов на пластинах NGM, дополняясь живым E. coli OP50 в качестве пищи.
2. Промыйте личинки L4, синхронизированные по возрасту, с помощью S-буфера и перенесите их (более примерно 500 червей) на обрабатывающие NGM-пластины, содержащие различные бактерии и химикаты. Инкубировать их при 20 °C в течение 48 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время обработки может варьироваться от 24 до 72 часов в зависимости от используемых бактерий и химикатов. Терапевтический или профилактический эффект DIM также можно оценить, предварительно обрабатывая глистов патогенами, а затем DIM (терапевтический эффект) или предварительное лечение DIM, а затем лечение патогенами (профилактический эффект).
3. Для подготовки пластин, добавленных FITC-декстраном, смешайте 2 мл термоинактивированного E. coli OP50 с 4 мг FITC-декстран. Затем разделите 100 мкл смеси FITC-декстран и E. coli OP50 на двадцать свежих NGM-агарных пластин (60 мм x 15 мм) и дайте пластинам высохнуть 1 час на чистом столе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация FITC-декстресна в каждой NGM-пластине составит 20 мкг/мл.
4. Подготовьте пять пластин с NGM, содержащие E. coli OP50, без FITC-декстран для управления транспортным средством. Для этого разделите 100 мкл термоинактивированного E. coli OP50 на каждую свежую пластину NGM agar (60 мм x 15 мм) и дайте пластинам высохнуть 1 час на чистом столе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого независимого эксперимента требуется пятнадцать пластин NGM, дополненных FITC-декстраном, и пять пластин NGM без FITC-декстена.
5. После 48 часов обработки (начиная с шага 7.2) промыйте червей S-буфером, перенесите червей на пластины с дополнением к FITC-декстрану и пластины NGM без FITC-дексона и инкубируют пластины на ночь (14–15 часов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой группы обработки требуется 5 повторений окрашивания FITC-декстран (или транспортного контроля).
6. Помойте червей S-буфером и дайте им погрузиться в свежую тарелку NGM агаром в течение 1 часа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого независимого эксперимента требуется всего 20 новых пластин NGM. На этом этапе вы можете использовать пластину NGM с добавлением E . coli OP50 или без неё.
7. Добавьте 50 мкл раствора формальдегида 4% в каждую яме черной пластины с плоским дном на 96 ям. Переместите примерно 50 червей из каждой NGM-пластины в каждую скважину для измерения флуоресценции. Через 1–2 минуты тщательно удалите весь формальдегид из каждой скважины и добавьте 100 мкл монтажного материала для покрытия колодцев.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор формальдегид (4%) используется для обездвиживания и фиксации червей. Для каждой группы обработки используется 5 колодцев (5 репликат) для анализа изображений.

5. Визуализация C. elegans с помощью системы оперетты и определение проницаемости кишечника путём измерения поглощения флуоресценцией FITC-декстран

ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентная стереомикроскопия может использоваться для анализа изображений вместо системы оперетты.

1. Захватывайте флуоресцентные изображения и измеряйте интенсивность флуоресценции с помощью системы высокого содержания Operetta и анализируйте изображения с помощью программного обеспечения Harmony.
2. В программном обеспечении Harmony нажмите значок « Открыть крышку », чтобы открыть крышку и вставить тарелку в машину.
3. Настройте параметры.
4. Нажмите «Настройка», выберите тип пластины (96-колодный Corning с плоским дном) и добавьте каналы (яркие и EGFP-каналы).
5. Скорректируйте планировку. Перейдём в раздел «Планировка», затем выберите «Трек » и настройте параметры (первая фотография на 1 мкм, количество плоскостей — 10, расстояние — 1 мкм).
6. Выберите одну из очищающих скважин и одно поле захвата и нажмите «Тест», чтобы проверить, удовлетворительные ли изображения в разделе «Запустить эксперимент».
7. Если фотографии удовлетворяют, вернитесь в раздел «Настройка » и нажмите значок «Сброс » в конце экрана. Затем выберите все целевые колодцы и подходящее количество полей захвата.
8. Перейдите в режим «Запустить эксперимент » снова и введите имя пластины, затем нажмите «Старт », чтобы начать обработку.
9. Чтобы измерить интенсивность флуоресценции, перейдите в раздел анализа изображения и введите изображение. Найдите клетку, выбрав канал EGFP (усиленный зелёный флуоресцентный белок) и метод B. Скорректируйте общий порог до 0,5, площадь до >200 мкм², коэффициент сплита до 3,0, индивидуальный порог до 0,18 и контраст более 0,18. Затем вычислите свойства интенсивности и выберите среднее в качестве выхода. Нажмите значок «Применить », чтобы сохранить настройки.
10. Перейдите в раздел «Оценка », чтобы измерить интенсивность, получив тепловую карту и таблицу данных. Установить параметр считывания на Cells — Intensity Cell EGFP Average — Mean per Well и начать оценку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.
11. Чтобы извлечь данные из Operetta, нажмите кнопку «Настройки » и выберите управление данными.
12. Выберите «Записать архив», затем откройте просмотр и выберите файл.
13. Чтобы выбрать файл, нажмите на маленький + в левом углу, затем выберите «Измерение » и выберите название пластины.
14. Выберите файл и нажмите OK.
15. Выберите путь для сохранения файла, нажав сигнал Browse на активном пути.
16. Нажмите Старт, чтобы сохранить файл данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.

Результаты

Рисунок 1: Влияние различных бактерий на проницаемость кишечника C. elegans. Микроскопические изображения червей, включая ярко-полевые, FITC-флуоресцентные (зелёный канал) и слияние изображений. Микроскопические изобр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
90×15 мм чашки Петри	SPL Life Sciences, Южная Корея	10090
60×15 мм чашки Петри	SPL Life Sciences, Южная Корея	10060
Бастор Агар	Бектон Дикинсон	ССЫЛКА 214010
Формальдегидное решение	Sigma	F1635
Инфузия мозга-сердца (BHI)	Бектон Дикинсон	ССЫЛКА 237500
Caenorhabditis elegans N2	Центр генетики Кенорхабдита (CGC)		Дикий тип
Тестовая пластина Costa, 96 колодец чёрный с прозрачным плоским дном, не обработанный, без крышки полистирол	Корнинг Инкорпорейтед	ССЫЛКА 3631
Escherichia coli OP50	Центр генетики Кенорхабдита (CGC)
Флуоресцеин изотиоцианат — декстран	Sigma	FD10S
Программное обеспечение Harmony	ПеркинЭлмер		Версии 3.5
Средний LB Лурия-Бертани	Merck	VM743185 626 1.10285.5000
Гептагидрат сульфата магния	Биореагенты Fisher	BP2213-1
Флюоромонтная водная монтажная среда	Sigma	F4680
Система высококонтентного анализа Operetta CLS	ПеркинЭлмер	HH16000000
Пептон	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Корейская коллекция по типографической культуре	KCTC NO 1637
Хлорид натрия	Биореагенты Fisher	BP358-1
Стереомикроскоп	Nikon, Япония	SMZ800N
Экстракт дрожжей	Бектон Дикинсон	ССЫЛКА 212750