$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Подготовка культур Salmonella Typhimurium ΔAroA для орального гагавания мышей
- Из замороженного глицеролового запаса S. Typhimurium ΔAroA подготовьте пластину с использованием агара Лурия-Бертани (LB agar), содержащего 100 мкг/мл стрептомицина с стерильной инокуляционной петлей. Инкубировать на ночь при 37 °C. Пластины Streak можно хранить до одной недели при 4 °C.
- За день до заражения приготовьте антибиотик, растворив 0,5 г стрептомицина в 2,5 мл воды. После фильтрации раствора стрептомицина внутрь вводите мышей с помощью иголки с наконечником 22 г и шприца объёмом 1 мл с 100 мкл раствора стрептомицина (20 мг стрептомицина/доза). Используя инокуляционную петлю, инокулятируйте 3 мл бульона LB (50 мкг/мл стрептомицина) в культурной трубке с одной колонией. Инкубировать сальмонеллу аэробно при 37 °C ночью с встряхиванием при 200 оборотах в минуту (RPM).
- В день заражения подготовьте окончательную дозу инфекции, проведя 2 последовательных разбавления ночных культур сальмонеллы 1/10 в стерильном физиологическом растворе с буфером фосфатов (PBS). В результате получится инокулям объемом 100 мкл, содержащий примерно 3 x 106 единиц формирования колоний (CFU).
- Используя иглу с лампочным наконечником 22G и шприц на 1 мл, каждому мыши введите 100 мкл приготовленной сальмонеллы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте культуры сальмонеллы с помощью асептических методов. Конечная концентрация инокуляции сальмонеллы может быть подтверждена путём серийного разбавления на LB агар стрептомицином.
2. Оценка нагрузки сальмонеллезы в тканях
- Подготовьте микротрубки с круглым дном объемом 2 мл, используя 1 мл стерильного PBS и автоклавную бусину из нержавеющей стали. Заранее взвесьте трубы перед сбором тканей.
- Удалить ткани целокожей и селезёнки у мышей, эвтаназированных воздействием углекислого газа. Собирайте ткани отдельных животных в отдельные трубки. Взвесьте трубки, чтобы определить вес тканей.
- Гомогенизация с помощью смесительного фрезера в течение 15 минут при 30 Гц. Перенос 900 мкл PBS на скважину в 96-колодный мегаблок объемом 2 мл. Пипетка 100 мкл ткани гомогенируется в первую яму, хорошо смешивает и проводит последовательные разбавления, добавляя 100 мкл в последующие ямы до получения разбавления 10⁻⁶. Пластинка 10 мкл каждого разбавления в тройной экземпляре на LB агар, содержащий 100 мкг/мл стрептомицина.
- Посчитайте и умножьте среднее CFU в 100 раз, так как 10 мкл из 1000 мкл образца были покрыты и соответствующий коэффициент разбавления. Разделите общий вес КФУ ткани на массу ткани, чтобы определить КФУ на грамм ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы храните на льду или при 4 °C во время обработки тканей. При серийном разбавлении с помощью гомогенатов тканей используйте наконечники пипеток с широким отверстием. Заранее подготовьте мегаблок на 96 лунок с PBS.