Подготовка Gardnerella vaginalis Inoculum для моделирования рецидивирующих инфекций мочевыводящих путей у мышей

Аннотация

Источник: O'Brien, V.P. и др . Рецидивирующая инфекция мочевыводящих путей Escherichia coli, вызванная воздействием мочевого пузыря Gardnerella vaginalis у мышей. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео демонстрируется подготовка инокулюма Gardnerella vaginalis для установления мышиной модели рецидивирующей инфекции мочевыводящих путей.

Протокол

1. Приготовьте инокулум Gardnerella vaginalis
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги выполняются в анаэробной камере. Идеальное время инкубации в культуре варьируется у разных штаммов G. vaginalis, некоторые из них переходят в стационарную фазу и даже начинают погибать быстрее, чем другие. Таким образом, время инкубации следует эмпирически определять для конкретного штамма до проведения экспериментов на мышах. Неизвестно, вызывают ли другие или все штаммы G. vaginalis такие же эффекты в этой модели.
2. Полоса G . vaginalis процеживается из морозильного материала при температуре -80 °C на пластину NYCIII (без антибиотиков). Инкубировать пластину при 37 °C анаэробно в течение 24 часов.
3. В анаэробной камере инокулируйте 5 мл анаэробной среды NYCIII петлей 1 мкл клеток (одной колонии недостаточно) из пластины NYCIII и инкубировать статически при 37 °C в анаэробных условиях в течение 18 часов. Не включайте антибиотики в форму роста.
4. Определите^{OD 600} культуры с помощью спектрофотометра
   1. Центрифугуйте определённый объём (X) культуры при 9600 × г в течение 1 минуты и аспирируйте среду. Вычислите объём (Y) фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для повторной суспензии гранулы с целью достижения желаемой оптической плотности (OD) и достижения 10⁸ единиц формирования колоний (CFU) за 50 мкл с помощью следующего уравнения: X mL × ODculture = Y mL × ^OD инокулум , решите YY = (X ml × ^{ODculture) / OD инокулям}
      ПРИМЕЧАНИЕ: ^{Инокулум} при передозировке JCP8151B^SmR составляет 5, но это необходимо определить эмпирически для других штаммов G. vaginalis. Например, при ночной жидкой культуре объемом 3 мл^{JCP8151B SmR} с ODculture = 2,0: Y= (3 мл × 2,0) / 5,0; следовательно, ресуспензировать гранулы в 1,2 мл PBS.
   2. Суспензировать бактериальную гранулу в PBS до нужной концентрации. Последовательно разбавляйте и помещайте инокулум в пластину, чтобы определить фактическую дозу инокуля, использованную в каждом эксперименте. Не полагайтесь только на передозировочные значения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Глюкоза	Sigma	G7528	Для среды роста G. vaginalis NYCIII
4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES)	Cellgro	25-060-CL	Для среды роста G. vaginalis NYCIII
Хлорид натрия	Sigma	S3014	Для среды роста G. vaginalis NYCIII
Протеозный пептон #3	Фишер	DF-122-17-4	Для среды роста G. vaginalis NYCIII
Экстракт дрожжей	Фишер	DF0127-17-9	Для среды роста G. vaginalis NYCIII
Спектрофотометр	BioChrom	80-3000-45	Измерение бактериального OD600
Стрептомицин	Gibco	11860038	Добавьте к селективным пластинкам G. vaginalis NYCIII (1 мг/мл)