Мышиная модель для изучения патогенного перехода Streptococcus pneumoniae после вирусной коинфекции

Аннотация

Источник: Ленхард, А. и др. Мышиная модель перехода Streptococcus pneumoniae из колонизатора в патоген при вирусной коинфекции повторяет возрастное обострение заболевания. J. Vis. Exp . (2022)

В этом видео демонстрируется модель коинфекции у мышей, при которой вирус гриппа запускает переход Streptococcus pneumoniae из колонизатора в патоген. В нём описываются этапы, связанные с колонизацией бактерий, вирусной инфекцией и прогрессированием заболевания.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Интраназальная инокуляция мышей Streptococcus pneumoniae, выращенными в биопленке , (S. pneumoniae)

1. Покупайте мышей и используйте их в нужном возрасте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши в возрасте 3-4 месяцев предпочитают моделировать молодых хозяев, а мыши в возрасте 21-24 месяцев могут использоваться для моделирования пожилых людей >65 лет. Представленные здесь данные взяты от самцов мышей C57BL/6.
2. Разморозить бактериальные аликвоты, выращенные в биопленке, на льду и открутить при 1700 × г в течение 5 минут. Аккуратно удалите и сбросьте супернатант, не повредив гранулу, промыйте бактерии, снова суспенировав гранулу в 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), и снова откройте при 1700 × г в течение 5 минут. Удалите супернатант и снова суспензуйте гранулу в нужном объёме для достижения нужной концентрации (стремитесь к 5 × 10 единицам для^{формирования} колоний (CFU)/10 мкл для интраназальной инокуляции). Подтвердите количество введённых бактерий, покрывая подготовленный инокулюм на пластины кровяного агара.
3. Инокуляция мышей интраназально с 5 × 10⁶ CFU, вводя 5 мкл разбавленной инокуляции в каждый нарис. Обязательно держите мышей крепко, стабилизируя голову, пока объём не будет вдулнут (обычно в течение нескольких секунд после пипета в нос). Выполняйте этот этап без анестезии, чтобы предотвратить аспирацию инокулума лёгочной.

2. Вирусная инфекция вирусом гриппа А (IAV)

1. Через 48 часов после интраназальной инокуляции S. pneumoniae оттаяйте интересующий штамм IAV на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Представленные здесь данные основаны на мышином штамме вируса гриппа A A/PR/8/34 H1N1, полученном путем совместного обмена.
2. После оттаивания вируса разведите его в PBS до нужной концентрации; Стремитесь к 20 единицам образования бляшек (PFU)/50 мкл при внутритрахеальной инфекции и 200 ПФУ/10 мкл при интраназальной инфекции. Для групп с имитационными инфицированными и только бактериями используйте PBS для вакцинации мышей.
3. Перед анестезией нанесите глазную смазку на глаза мышей. Анестезируйте мышей с использованием 5% изофлурана и подтвердите анестезию сильным щипком пальца ног.
4. После анестезии его вытащите из камеры изофлурана и немедленно инфицируйте мышей 50 мкл (20 ПФУ) внутритрахеально с помощью тупого пинцета, чтобы вытащить язык изо рта и пропустить объём жидкости по трахее.
5. Поместите мышей в отдельную клетку и наблюдайте за ними до полного восстановления (они способны поддерживать грудинальное лежание [могут лежать прямо на груди]).
6. После восстановления немедленно интраназально вводите мышам 10 мкл (200 ПФУ) IAV с помощью метода прививки на шаге 1.3.
7. Домашние мыши, перенесшие одиночную или двойную бактериальную и вирусную инфекцию с одной и той же группой инфекций и отделённые от других групп.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4-аминобензойная кислота	Фишер	AAA1267318	Микс I stock
Фильтры 100 мкм	Фишер	07-201-432
Полиэтиленовая трубка BD Intramedic	Фишер	427410	Трубка для промывания носа
Одноразовые шприцы BD с наконечниками Luer-Lok (1 мл)	Фишер	14-823-30
D39	Национальная коллекция типовой культуры (NCTC)	NCTC 7466	Штамм Streptococcus pneumoniae
Пиветальный изофлуран	Patterson Veterinary	07-893-8440	Изофлуран для анестезии во время инфекции
Thermo Scientific Blood Agar с гентамицином	Фишер	R01227	Пластины кровяных агаров с антибиотиком гентамицином
TIGR4	ATCC	BAA-334	Штамм Streptococcus pneumoniae