Обработка инфицированных тканей для бактериального перечисления в модели коинфекции у мышей

Аннотация

Источник: Ленхард, А. , и др .Мышиная модель перехода Streptococcus pneumoniae из колонизатора в патоген при вирусной коинфекции повторяет возрастное обострение заболевания. J. Vis. Exp . (2022)

Это видео демонстрирует обработку лёгких мыши, соинфицированной патогенной бактерией и вирусом. Помельчение, гомогенизация и покрытие легкой ткани позволяют количественно оценить нагрузку бактерий, указывая на распространение бактерий в лёгкие и степень тяжести заболевания.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Обработка инфицированных тканей для бактериального перечисления

1. Коллекция лёгких
   1. С помощью ножниц для вскрытия сделайте разрез по бокам открытой грудной клетки и аккуратно подтяните рёбра к голове мыши, чтобы открыть сердце. Введите в правый желудочек иглу объемом 25 G, прикреплённую к шприцу объемом 10 мл, предварительно заполненному фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), и начните медленное перфузирование. Обратите внимание на обесцвечивание лёгких как на показатель успешной перфузии. Промывайте медленно, чтобы не повредить лёгочную ткань.
   2. Поднимите сердце щипцами и сделайте разрез, чтобы отделить лёгкие и сердце. После отделения соберите все доли лёгких щипцами и прополосните в чашке стерильным PBS, чтобы удалить остатки крови. В чашке Петри измельчите лёгкие на мелкие кусочки и хорошо перемешайте. Удалите половину легочной смеси для определения бактериальных колониообразующих единиц (CFU) или вирусных бляшек (PFU) и поместите её в круглодонную трубку объёмом 15 мл, предварительно заполненную 0,5 мл PBS для гомогенизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не брать разные доли одного и того же легкого для различных оценок. Вместо этого все доли должны быть измельчены, хорошо смешаны и равномерно разобраны для различных оценок.
2. Чтобы гомогенизировать собранную ткань, сначала очистите зонд-гомогенизатор, добавив 70% этанола и включите гомогенизатор на мощности 60% в течение 30 секунд. Повторяйте этот шаг в стерильной воде в течение 10 секунд. Униформируйте каждую ткань на 1 минуту. Очистите зонд гомогенизатора в стерильной воде между образцами и в свежей трубке с 70% этанолом между органами и группой образцов.
3. Перечисление численности бактерий
   1. После того как все органы были извлечены и гомогенированы, на пластинах кровяных агаров проводятся серийные разбавления. Для расчёта общего CFU используйте 10 мкл для пластины и записите итоговый объём в мл для каждого образца. Инкубировать ночь при 37 °C/5%_CO2.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Одноразовые шприцы BD с наконечниками Luer-Lok (1 мл)	Фишер	14-823-30
Тонкие ножницы для препарирования Fisherbrand	Фишер	08-951-5	Инструменты, используемые для сбора
Вскрытие тканевых щипцов Фишербранда	Фишер	13-812-38	Щипцы для сбора урожая
Стерильные шприцы Fisherbrand для одноразового использования (10 мл)	Фишер	14-955-459