Создание монослоя человеческой колоноидной колонки с функцией барьера для изучения взаимодействий хозяина и патогена

Аннотация

Источник: Ин, Дж. Г. и др. Монослои колоноидов человека для изучения взаимодействий между патогенами, коммензалами и эпителием кишечника хозяина. J. Vis. Exp . (2019).

В этом видео демонстрируется процедура культивирования эпителиальных клеток, полученных из толстой кишки, на системе Трансвелла, покрытой коллагеном, с целью создания монослоя, образующего слизь, который моделирует кишечный барьер и позволяет исследовать взаимодействие хозяина с патогеном.

Протокол

1. Покрытие энтероидной/толстой суспензии

1. Если покрытые вставки хранились при 4 °C, их уравновесить в инкубаторе для культуры тканей с содержанием_CO2 не менее 30 минут до покрытия клеточной пластиной.
2. Для каждой вставки подготовьте 1 мл тёплой (от 25 до 37 °C) расширяющей среды (EM) и добавьте 10 мкм Y-27632 и 10 мкм CHIR 99021.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ЭМ состоит из Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) /F12, содержащего B27 (1x), 50% WNT3A с кондиционированной средой, 15% RSPO1 с кондиционированной средой, 10% среды с кондиционированием Noggin, 50 нг/мл человеческого EGF (эпидермальный фактор роста), 500 нМ A-83-01, 10 мкм SB 202190, антибиотик/антимикотический коктейль (1x), 10 mM HEPES (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновая кислота)), L-аланил-L-глутамин дипептид (1x) и пенициллин-стрептомицин (1x) (см. Таблицу материалов).
3. Аспирировать промывательную среду из трубки, содержащей клеточную гранулу, и ре-суспензировать в объёме электромагнитного вещества, достаточном для получения не менее 100 мкл на вставку.
4. Аспирируйте раствор коллагена внутривенно из каждой вставки и дважды промывайте 150 мкл средство для стирки на вставку.
5. Пипетка — 600 мкл ЭМ в пространство под каждой вставкой.
6. Пипетка — 100 мкл суспензии клетки в каждую вставку.
7. Верните пластину в инкубатор для культуры тканей и оставьте её нетронутой как минимум на 12 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте встряхивания или резкого наклона пластины, чтобы предотвратить неравномерное распределение фрагментов колоноида на мембране вставки.
8. Следите за прикреплением и распространением клетки для формирования слияющегося монослоя, поместив пластину на фазово-контрастный световой микроскоп под объективной линзой 2,5x-10x.
9. Через 1-2 дня большинство фрагментов должны прилипнуть к коллагеновой матрице. Обновите культурную среду и прекратите обработку с помощью Y-27632 и CHIR 99021. Продолжайте обновлять среду каждые 2-3 дня до слияния. Сливание обычно достигается за 7–10 дней.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол	Sigma	T4661	Трис-база, компонент буфера лизиса
A-83-01	Токрис	2939	Ингибитор ALK4/5/7
Уксусная кислота, ледниковая	Fisher Scientific	A38
Продвинутый DMEM/F12	Жизненные технологии	12634-010	Компонент среды роста
Коктейль антибиотиков/антимикотов	Invivogen	ANT-PM-2	Primocin (100x)
B27, 50x	Жизненные технологии	17504-044	Компонент среды роста
Вставки для клеточной культуры	Корнинг	3470	Трансвелл, ПЭТ-мембрана, поры 0,4 мкм, пластина с 24 лунками
CHIR 99021	Токрис	4423	Ингибитор GSK3β
Коллаген IV из плаценты человека	Sigma	C5533
Раствор для сбора органоидов Cultrex	Тревиген	3700-100-01	Деполимеризует матрицу базальных мембран
Этанол, абсолют	Pharmco	111000200
GlutaMAX	Жизненные технологии	35050-061	L-аланиил-L-глутамин дипептид, 200 мМ
Линия HEK293T/Noggin-Fc	лаборатория ван ден Бринк, Институт исследований печени и кишечника Tytgat		Для производства среды с кондиционированным Ноггином
Клеточная линия HEK293T/RSPO1-Fc-HA	Тревиген	3710-001-K	Для производства среды с кондиционированием Rspondin-1
HEPES, 1 M	Жизненные технологии	15630-080	Компонент среды роста
Эпидермальный фактор роста человека (EGF)	Научно-исследовательские системы	236-EG-01M	Компонент среды роста
Инвертированный световой микроскоп для культивирования клеток	Олимп	CKX51
Ячеточная линия L-WNT3A	ATCC	CRL-2647	Для производства среды с кондиционируемым Wnt3a
Матригель, сниженный фактор роста	Корнинг	356231	Матрица базальных мембран для 3D-культуры
Мини-скребок для ячейки	United BioSystems	MCS-200
Антитело к MUC2, моноклональное у мыши	Abcam	ab11197	Используйте 1:100 для иммунокрашивки, 1:500 для иммуноблотинга
Лентивирусные частицы MUC2 шРНК	GE Dharmacon	RHS4531	GIPZ лентивирусный шРНК, ID: 4583
Орбитальный встряхивающий	Грант Инструментс	PSU-10i
Пенициллин-стрептомицин, 100 раз	Жизненные технологии	15140-122	Компонент среды роста
Зондовый соникатор с микронаконечником	Branson Ultrasonics	450
Коктейль ингибиторов протеазы для клеток млекопитающих	Sigma	P8340	Компонент буфера лизиса
SB 202190	Токрис	1264	Ингибитор p38 MAPK
Хлорид натрия	Sigma	S3014	Компонент буфера лизиса
Дексохолат натрия	Sigma	D6750	Компонент буфера лизиса
Додецилсульфат натрия	Sigma	L3771	Компонент буфера лизиса
TrypLE Express, 1x	Жизненные технологии	12605-010	Трипсин — для переваривания фрагментов энтероидных/колоноидных
Винкулиновое антитело, моноклональное кролика	Abcam	ab129002	Используйте при 1:1000 для иммуноблотирования
Вода, сорт культуры тканей, стерильная фильтрация	Корнинг	25-055
Y-27632	Токрис	1254	Ингибитор RhoA/ROCK