Образование сферопластов из грамотрицательных бактерий

Аннотация

Источник: Figueroa, D. и др. Производство и визуализация бактериальных сферопластов и протопластов для характеристики локализации антимикробных пептидов. J. Vis. Exp . (2018).

В этом видео демонстрируется приготовление сферопластов из палочкообразных, грамотрицательных бактерий. Бактерии выращиваются в присутствии антибиотика для образования удлинённых нитей. Их промывают гипертоническим раствором и обрабатывают буфером для удаления внешней клеточной стенки. Гипотоническое лечение образует сферопласты, которые стабилизируются охлаждённым изотоническим раствором и хранятся в холодных условиях.

Протокол

1. Подготовка раствора

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте растворы, описанные в шагах 1.1–1.9, чтобы получить сферопласты Escherichia coli (E. coli )

1. Приготовьте 1 M трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорида (Tris-Cl) с pH 7,8, растворив 10,34 г Tris·HCl и 4,17 г трис(гидроксиметил)аминометана (Tris·OH) в 50 мл дистиллированной воды (dH₂O) в колбу объемом 125 мл. Стерилизуйте, фильтруя через шприцовый фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и храните в конической трубке при комнатной температуре.
2. Приготовьте раствор A (20 мМ хлорида магния (MgCl₂), 0,7 млн сахарозы, 10 мМ Tris-Cl, pH 7,8), растворив 0,10 г MgCl₂ (95,2 г/моль) и 11,98 г сахарозы (342,3 г/моль) в 25 мл dH₂O в колбе объёмом 125 мл. Добавьте 500 мкл 1 м Tris-Cl (pH 7,8) и отрегулируйте объём до 50 мл. Стерилизуйте, фильтруя через шприцовый фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и храните в конической трубке при комнатной температуре.
3. Приготовьте раствор B (10 мМ MgCl₂, 0,8 млн сахарозы, 10 мМ Tris-Cl, pH 7,8), растворив 0,05 г MgCl₂ (95,2 г/моль) и 13,69 г сахарозы (342,3 г/моль) в 25 мл dH₂O в колбе объемом 125 мл. Добавьте 500 мкл 1 м Tris-Cl (pH 7,8) и отрегулируйте объём до 50 мл. Стерилизуйте, фильтруя через шприцовый фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и храните в конической трубке при комнатной температуре.
4. Приготовьте сахарозу объёмом 0,8 м, растворив 13,69 г сахарозы (342,3 г/моль) в 50 мл dH₂O в колбе объёмом 125 мл. Стерилизуйте, фильтруя через шприцовый фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и храните в конической трубке при комнатной температуре.
5. Подготовьте 5 мг/мл дезоксирибонуклеазы I (DNase I), растворив 0,015 г DNазы I в 3 мл dH₂O в колбе объемом 50 мл. Стерилизуйте, фильтруя через шприцовый фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм. Раствор аликвот в микрофужные трубки и хранить при −20 °C.
6. Подготовьте 0,125 м этилендиаминететрауксусной кислоты (ЭДТА), pH 8,0, растворив 0,698 г дисотрия ЭДТА (372,2 г/моль) в 15 мл dH₂O в колбе объемом 125 мл. Стерилизуйте, фильтруя через шприцовый фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и храните в конической трубке при комнатной температуре.
7. Приготовьте 600 мкг/мл цефалексина, растворив 0,03 г цефалексинового гидрата (365,404 г/моль) в 50 мл dH₂O в колбе объемом 125 мл. Стерилизуйте, фильтруя через шприцовый фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и храните в конической трубке при температуре 4 °C.
8. Приготовьте лизоцим 5 мг/мл, растворив 0,015 г лизоцима в 3 мл dH₂O в колбе объемом 50 мл. Стерилизуйте, фильтруя через шприцовый фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм. Раствор аликвот в микрофужные трубки и хранить при −20 °C.
9. Приготовьте 3% с триптиказным соевым бульоном (TSB), растворив 30 г TSB в 1 л dH₂O в колбе на 2 л. Аликвот раствора в колбы с 25 мл или 100 мл TSB для приготовления сферопластов E. coli или B. megaterium protoplasts соответственно. Колбы автоклава для стерилизации жидкой среды. Стерильный TSB можно хранить при комнатной температуре или при 4 °C.
10. Приготовьте раствор C (1 млн сахарозы, 0,04 млн малеата, 0,04 млн мгCl₂, pH 6,5) растворив 34,23 г сахарозы (342,3 г/моль), 0,46 г малеиновой кислоты (116,07 г/моль) и 0,38 г MgCl₂ (95,21 г/моль) в 100 мл dH₂O в колбе объёмом 250 мл. Отрегулируйте pH до 6,5. Стерилизуйте, фильтруя через шприцовый фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и храните в конической трубке при комнатной температуре.

2. Подготовка ночной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте секции 2-3 с использованием соответствующих стерильных техник. При желании бактериальный штамм может содержать плазмиду для устойчивости к антибиотикам, чтобы снизить потенциальное загрязнение. Если вы используете штамм с резистентностью к антибиотикам, добавьте необходимые антибиотики в шагах 2.1 и 3.1–3.2.

1. Подготовьте ночную культуру, отобрав одну колонию бактерий с помощью стерильного наконечника пипетки и поместив её в пробирку объемом 14 мл с 2–3 мл 3% с TSB. Инкубировать при 37 °C, встряхивая 16–21 час.

3. Подготовка грамотрицательных E . coli Spheroplast

1. В колбе объёмом 250 мл разведите ночную культуру 1:100 в объеме 25 мл 3% с TSB и инкубуйте бактериальный раствор при 37 °C, встряхивая примерно 2,5 часа, пока раствор не достигнет оптической плотности 0,5–0,8 на 600 нм. Измерьте оптическую плотность с помощью спектрофотометра.
2. В колбе объёмом 250 мл разведите эту культуру в соотношении 1:10 в 30 мл 3% w/v TSB и инкубируют при 37 °C, встряхивая 2,5 часа в присутствии цефалексина 60 мкг/мл (347,4 г/моль), чтобы получить одноклеточные филаменты длиной около 50–150 мкм, которые можно наблюдать при увеличении 1000 раз с помощью светового микроскопа (рисунок 1B).
3. Собирайте филаменты, центрифугая бактериальный раствор при температуре 1 500 x g, 4 °C в течение 4 минут. Декантируйте и отбрасывайте супернатант, оставляя гранулу.
4. Промыйте филаменты, аккуратно добавив 1 мл сахарозы 0,8 м, стараясь не трогать гранулы. Инкубировать 1 минуту, затем выбросить супернатант, не трогая гранулу.
5. Добавьте 150 мкл 1 м трис-кл (pH 7,8), 120 мкл лизозима 5 мг/мл, 30 мкл 5 мг/мл ДНКазы I и 120 мкл 0,125 М ЭДТА в соответствующем порядке и инкубировать раствор при комнатной температуре в течение 10 минут.
6. Добавляйте 1 мл раствора A постепенно в течение 1 минуты в раствор, приготовленный за 3,5 дюйма, используя микропипетку, аккуратно перемешивая его вручную. Инкубировать раствор 4 минуты при комнатной температуре.
7. Введите 7 мл раствора B при температуре 4 °C в две конические трубки по 15 мл. Добавьте равное количество раствора, приготовленного в 3,6 дюйма, в каждую из этих двух пробирок. Центрифугуйте раствор при температуре 1 500 x g, 4 °C в течение 4 минут.
8. Используя серологическую пипетку, аккуратно удаляйте все, кроме 1-2 мл супернатанта, не нарушая гранулу. Подвесьте гранулу, аккуратно протирая вверх и вниз с помощью микропипетки P1000. Визуально проверьте образование сферопластов, наблюдая образец при увеличении 1000 раз с помощью светового микроскопа (рисунок 1C).
9. Храните сферопласты при -20 °C до недели или до тех пор, пока они не пройдут три цикла заморозки и оттаивания.

Результаты

Рисунок 1: Репрезентативные изображения Escherichia coli. (A) бактерий E. coli , ( B) E . coli и ( C) E . coli spheroplast. Изображения были сделаны при увеличении 100 раз.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Тризма-гидрохлорид (Tris HCl)	Sigma	T3253
База Тризмы (Трис, Огайо)	Sigma	T1503
Хлорид магния	Sigma	M8266
Сахароза	Sigma	S7903
Лизоцим	Sigma	L6876
Дезоксирибонуклеаза I	Sigma	D4527
Этилендиаминтетрауксусная кислота	Sigma	106361	Использовал Sigma 106361 при разработке оригинального протокола; 106361 был снят с производства с ED2SS в качестве замены
Цефалексин гидрат	Sigma	C4895
BBL Trypticase соевый бульон	Fisher Scientific	B11768
Малеиновая кислота	Sigma	M0375
Шприцовый фильтр Acrodisc 25 мм с мембраной HT Tuffryn 0,2 мкм	Корпорация Палл	4192