Создание мышиной модели вагинальной стрептококковой инфекции группы B

Аннотация

Источник: Патрас, К. А., Доран, К. С. Мышиная модель колонизации группы B стрептококка вагинальной колонизации. J. Vis. Exp . (2016)

В этом видео демонстрируется подготовка и вагинальная прививка самок мыши, обработанной гормонами, стрептококком группы B, для моделирования инфекции. В ней объясняется, как культивировать и готовить бактерии, вводить прививку во влагалищный просвет и обеспечивать успешное заражение.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Вагинальная прививка стрептококком группы B (GBS)

1. За день до инокуляции выращивайте 5-мл ночные жидкую культуру интересующего штамма GBS, например A909 (серотип Ia), в бульоне Тодда Хьюитта (THB) при 37 °C.
2. Субкультивировать GBS за ночь в объеме 1:10 в свежий THB и инкубировать при 37 °C. Вырастить бактерии до средней фазы логарифма (_{OD 600} = 0,4-0,5).

ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это занимает 2–3 часа, в зависимости от штаммовой формы GBS.

3. Перенесите субкультуру в стерильную коническую трубку объёмом 15 мл и бактерии с гранулами при 3 000 × г на 5 минут. Аспирировать супернатант. Повторная суспензия бактериальных гранул в 200 мкл стерильного фосфат-буферного физиологического раствора (PBS).
4. Используя ресуспендированную гранулу, доведите 3–5 мл PBS (1 мл на 10 мышей) ровно до_{OD 600} = 0,4 в новой 5-мл пробирке для культуры. Это будет концентрация ~ 1 × 10⁸ единиц формирования колоний (CFU)/мл. Перенесите в новую коническую трубку объёмом 15 мл и повторно пеллетуйте бактерии при 3 000 × г в течение 5 минут. Аспирировать супернатант.
5. В PBS подвесьте пеллету на 1/10 исходного объёма. Например, если было гранулировано 3 мл_{OD 600} = 0,4, то ресуспензировать его в 300 мкл PBS.

ПРИМЕЧАНИЕ: Это последняя бактериальная суспензия (~ 1 × 10⁹ CFU/мл), используемая для инокуляции животных.

6. Оставьте 50 мкл этой суспензии для серийного разведения и нанесения на THB-агар с целью определения точного инокулума.
7. Каждую мышь введите 10 мкл конечной бактериальной суспензии, чтобы на каждую мышь вводилось 1 ×^{10 7} КФУ.
   1. Чтобы сделать прививку, удержите мышь вручную, закрепив обвисшую кожу на загривке шеи между большим и указательным пальцами, а затем обездвижите хвост.
   2. Набрать 10 мкл GBS в наконечник гелевой загрузки объёмом 200 мкл. Введите кончик на 5–10 мм в просвет влагалища и выпустите 10 мкл инокуля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гелевые насадки предпочтительнее стандартных 200-мкл для минимизации риска травм или травм органов, особенно у молодых или маленьких мышей.
   3. Сразу после прививки отпустите загривок на шее и поднимите задний конец мыши, поднимая её за хвост и ходя передними лапами по твёрдой поверхности ~ 1 минуту.
   4. Визуально осмотрите отверстие влагалища на наличие обратного потока инокулума. Если наблюдается обратный поток, можно использовать свежий наконечник пипетки для манипуляции или увеличения влагалищного отверстия, что облегчает поглощение обратного потока в просвет. Кроме того, обратный поток может быть аспирирован через пипетку и повторно инокуляционен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При введении топических средств, пробиотических организмов или белков, представляющих интерес, в вагинальный тракт может быть введён объем до 20 мкл в физиологическом буфере.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
200 мкл гелевых наконечников пипеток	USA Scientific	1252-0610
Тодд Хьюитт Бульон	Hardy Diagnostics	7161C
Раствор соли, буферированный фосфатом Dulbecco, 1x	Корнинг	21-031-CV