Количественная оценка подавления биопленки, вызванной ферментами, у патогенных бактерий

Аннотация

Источник: Tay, S. B. и др. Антивирулентное нарушение патогенных биопленок с использованием инженерных лактоназ, погасящих кворум. J. Vis. Exp . (2016)

В видео демонстрируется метод количественной оценки биопленки в патогенной бактерии, сравнивая необработанные контрольные группы с образцами, обработанными ферментом, утискающим кворум. Фермент нарушает бактериальную сигнализацию во время ранней инкубации, снижая клеточную адгезию. После промывки и дальнейшей инкубации контрольные скважины образуют плотные биопленки, тогда как обработанные скважины демонстрируют снижение образования. Для окрашивания биопленки используется катионный краситель, а для оценки биомассы измеряется поглощение.

Протокол

1. Кристаллическая фиолетовая количественная оценка образования биопленки у A. baumannii S1

1. Выращивайте культуру Acinetobacter baumannii S1 (A. baumannii) объемом 5 мл в бульоне Лизогенез (LB) (триптон 10 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л) при 30 °C в встряхивающем инкубаторе (220 об/мин) в течение 16 часов.
2. Скорректируйте культуру A. baumannii S1 до желаемой оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀) 0,8. Используя пластину на 96 лунок, инокулируйте бактериальную культуру (разбавление 1:100) в свежий LB, содержащий 10 мкл очищенного фермента GKL (40 мг/мл); Последний объём новой культуры — 100 мкл.
3. Также подготовьте культуру контроля; Он не содержит никакого фермента. Повторите аналогичные условия, чтобы получить нужное количество репликатов.
4. Накройте тарелку крышкой и поставьте её в герметичный пластиковый контейнер объёмом 10 л. Инкубировать тарелку при 30 °C в течение 3 часов, прежде чем аккуратно снять среду.
5. Добавьте ещё 100 мкл свежей LB среды в колодец и инкубируете тарелку 21 час при 30 °C.
6. После второго периода инкубации аккуратно удалите все материалы. Промыйте планктонную бактериальную клетку стерильной водой объемом 200 мкл. Убедитесь, что во время мытья клетки будут минимальными нарушениями.
7. Добавьте 100 мкл 1% раствора кристаллического фиолетового в каждую колодку и инкубировать 15 минут при комнатной температуре. Удалите кристаллический фиолетовый раствор, промыв колодец стерильной водой объемом 200 мкл. Повторите стирку ещё два раза.
8. Добавьте 100 мкл уксусной кислоты 33% в каждую скважину и инкубуйте 15 минут с лёгким встряхиванием; Это растворит краситель.
9. Количественно определите количество образуемой биопленки, измеряя поглощение кристаллической фиолетовой на расстоянии 600 нм. Количество кристаллической фиолетовой пропорционально образованной биопленке.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Триптон	BD	211705
Дрожжевый экстракт	BD	212750
96-колодцевая пластина	Costar	3596
Кристал Фиолетовая	Сигма-Олдрич	C6158
Уксусная кислота	Лабораторное сканирование	PLA00654X	Предупреждение: Горючий
Synergy HT Microplate Reader	BioTek