1. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия биопленки A. baumannii S1
1. Вырастить культуру A. baumannii S1 объёмом 5 мл в LB при 30 °C в встряхивающем инкубаторе (220 об/мин) в течение 16 часов.
2. Скорректируйте культуру A. baumannii S1 до желаемогоOD 600 равного 0,8. Используя стеклянный μ-Dish диаметром 35 мм, инокулируйте бактериальную культуру (разбавление 1:100) в свежий LB, содержащий 30 мкл очищенного фермента GKL (40 мг/мл); Последний том New Culture — 1 мл.
3. Накройте μ-Dish крышкой и поставьте её в герметичный пластиковый контейнер на 10 л. Инкубировать μ-Dish при 30 °C в течение 3 часов, прежде чем аккуратно удалить среду. Добавьте 30 мкл очищенного фермента GKL и свежую среду, доведя общий объём до 1 мл. Инкубировать ещё 21 час при 30 °C.
4. Повторите шаг 1.3 и инкубируете μ-тарелку ещё 24 часа при 30 °C. Затем аккуратно уберите медиа.
5. Добавьте 500 мкл 5 мкг/мл аглютинина Alex Fluo 488-конъюгированного зародыша пшеницы (WGA), растворённого в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS), в μDish и инкубировать при 37 °C в течение 30 минут; Это окрашивает сформированную биопленку. Удалите раствор для окрашивания и помойте μ-Dish 2 мл HBSS. Повторите этап стирки ещё раз.
6. Добавить 500 мкл 3,7 % формальдегида, растворённого в HBSS, и инкубировать при 37 °C в течение 30 минут; это закрепит биопленку на μ-Dish. Промой μDish один раз 2 мл HBSS, а затем полностью удалите раствор. μ-антенна, закрепленная биопленкой, может храниться в темноте при 4 °C до проведения CLSM-визуализации.
7. Для CLSM-визуализации и анализа используйте 63-кратное увеличение для генерации 97 стеков на изображение с интервалом 0,21 мкм на стек.
