Обнаружение сахаробактерий в бинарной культуре с помощью полимеразной цепной реакции

Аннотация

Источник: Коллинз, А. Дж. и др., Установление стабильных бинарных культур симбиотических сахарибактерий из полости рта. J. Vis. Exp . (2021)

В этом видео демонстрируется использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения сахаробактерий в бинарной культуре с актиномицесами. Протокол описывает амплификация ДНК и гель-электрофорез для подтверждения стабильного взаимодействия хозяина и паразита.

Протокол

1. Подтвердите инфекцию сахаробактериями с помощью ПЦР
   1. После 5 проходов подтвердите инфекцию полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Пять проходов гарантируют, что любые нерастущие клетки сахаробактерий были истощены сверх предела обнаружения с помощью 25 циклов ПЦР.
   2. Подготовьте мастер-микс для ПЦР. Рекомендуемый рецепт такой: для каждой необходимой трубки подготовьте 12,5 мкл 2x ПЦР-буфер, 0,75 мкл 10 мкм прямой праймер (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 мкл 10 мкм Обратный праймер (1177R¹³- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCT), 1 мкл 25 мМ MgCl_{2, и 9} мкл воды. Смешивайте с помощью вихря.
   3. Аликвот 24 мкл мастер-микса в ПЦР-лампу объемом 0,2 мл. Добавьте 1 мкл культуры, инфицированной сахаробактериями, в реакцию ПЦР. Поместите трубку в термоциклер и выполните следующий протокол: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 минут, 25 циклов по 95 °C в течение 30 секунд, 60 °C 30 секунд, 72 °C 30 секунд, финальная удлинение при 72 °C в течение 2 минут, затем окончательная задержка при 4 °C.
   4. Загрузите и запустите ПЦР-продукты в 1% агарозном геле. Полоса из ~600 оснований указывает на наличие сахаробактерий.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агарозе	Fisher Scientific	BP160-100
Brain Heart Infusion Broth (обезвоженный порошок)	Бектон-Дикинсон	211059	Или другие среды роста, подходящие для целевых организмов
Электрофорезный блок питания	Био-Рад	1645052
Установка электрофореза	Био-Рад	1704467
GoTaq Green Mastermix	Promega	M7122
Mastercycler Pro Thermocycler	Эппендорф	950040025	Или аналогичный термоциклер для ПЦР
MgCl₂ раствор 25mM	Promega	A3513
Вода класса молекулярной биологии	Fisher Scientific	BP2819100
Микропипетка P-1000	Гилсон	F123601G
ПЦР-лампы 0,2 мл	Fisher Scientific	14-230-205
Кончики пипетт — 1000 мкл	Fisher Scientific	02-717-166
Окраска SYBR Safe DNA Gel	ThermoFisher Scientific	S33102
Триптический соевый бульон (обезвоженный порошок)	Бектон-Дикинсон	211825	Или другие среды роста, подходящие для целевых организмов