$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение всего эксперимента клетки макрофагов инкубируются при 37 °C в инкубаторе с принудительным воздушным содержанием 5%CO2 и выводятся из инкубатора только для экспериментальных работ, которые проводятся в биологическом защитном шкафу класса II. Работа с бактериями Listeria monocytogenes соответствует требованиям биологического уровня безопасности 2.
1. Подготовка клеток и бактериальная инфекция (дни 1 и 2)
- День 1
- Семена 2,0 x 107 макрофаговых клеток, полученных из костного мозга (BMDM) на тарелке диаметром 145 мм в среде 30 мл BMDM + Pen-Strep (Таблица 2). Семя — 3 пластины для каждого бактериального штамма, который будет анализироваться. Инкубировать ночь при 37 °C в инкубаторе с принудительным воздушным давлением 5%CO2 .
- Начните ночную бактериальную культуру дикого типа (WT) штамма L. monocytogenes 10403S в 10 мл среды для инфузии мозга-сердца (BHI) при 30 °C в стандартном инкубаторе. Размещайте культурные трубки наклонными, не дрожащие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти условия роста повышают экспрессию генов жгутиков, что способствует эффективной инфекции.
- День 2
- Предварительное разогревающее средство BMDM (без антибиотиков Pen-Strep) (Таблица 2) и фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) при 37 °C.
- Промыйте монослой макрофага дважды с помощью 25 мл предварительно подогреного PBS для удаления антибиотиков. Добавьте 30 мл свежего BMDM среднего масла.
- Промыть 1,5 мл ночной бактериальной культуры с PBS, центрифугировав бактерии в > 14 000 x g в течение 1 минуты, выбросить супернатант и аккуратно восстановить бактерии в 1,5 мл PBS с помощью пипетирования. Повторите дважды.
- Инфицировать каждую макрофаговую пластину 0,5 мл ночной культуры дикого типа L. monocytogenes. Если используете несколько пластин, инфицируйте каждую пластину с интервалом в 15 минут. Этот промежуток времени позволит собирать каждую тарелку отдельно в конце инфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Множественность инфекции (МОИ) измеряется путём серийного разбавления бактериальных культур, используемых для заражения, на агарных пластинах BHI, и подсчёта колониообразующих единиц (CFU) после 24-часовой инкубации пластин при 37 °C. Использование 0,5 мл штамма WT L. monocytogenes 10403S даёт MOI ~ 100 (100 бактерий КФУ на макрофаговую клетку). При анализе бактериальных мутантов, дефектных в внутриклеточном росте, следует учитывать более высокий MOI. - После инкубации в течение 0,5 часов при 37 °C промыйте инфицированные клетки дважды PBS, чтобы удалить отделённые бактерии, и добавьте 30 мл предварительно нагретой среды BMDM. Прикреплённые бактерии интернализируются в течение следующих 0,5 часа.
- Через 1 час после заражения добавьте 30 мкл гентамицина (1:1 000 для достижения конечной концентрации 50 мкг/мл) для уничтожения внеклеточных бактерий.
- Собрать фильтрующий аппарат, разместив фильтрующую головку на колбу для сбора жидкости с вакуумным выходом. Затем разместить фильтр (0,45 мкм) на головку фильтра, затем воронку цилиндра и закрепить разные части металлическим зажимом. Приготовьте ледяную воду без РНаз.
- Через 6 часов после заражения извлекайте бактерии из заражённых клеток следующим образом. Обрабатывайте каждую тарелку индивидуально.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно L. monocytogenes завершает 1-лог роста в течение 6 часов инфекции в макрофаговых клетках. Более длительные инкубации могут привести к чрезмерному росту бактерий и гибели макрофагов клеток, тогда как короткие инкубационные периоды могут привести к значительно снижению бактериальной нагрузки. МОИ и время заражения могут быть изменены для достижения оптимальных условий.- Один раз промывайте заражённые клетки PBS. Добавьте 20 мл ледяной воды без РНаз, чтобы лизировать макрофаговые клетки. С помощью скребка клетки быстро, но аккуратно соскребли клетки с пластины.
- Соберите лизированные клетки в коническую трубку объемом 50 мл. Вихрь на 30 секунд. Центрифугу при 800 x g в течение 3 минут при 4 °C.
- Пропустите супернатант через фильтрующий аппарат с помощью вакуумной системы. С помощью пинцета скрутите фильтр и быстро перенесите его в коническую трубку объемом 15 мл. Заморозьте трубки с фильтрами в жидком азоте.
- Соберите фильтрационный аппарат с новым фильтром для следующего образца, как описано в 1.2.7.
- Замороженные фильтры храните при -80 °C на следующий день. Или напрямую перейти к экстракции нуклеиновых кислот.
Таблица 1: Протокол реакции DNase.
| РНК | до 2 мкг (в максимальном объёме 44 мкл) |
| Буфер 10x DNase | 5 мкл |
| Вода без РНазы | полный объём до 50 мкл |
| DNAse | 1 мкл (1 единица) |
Таблица 2: Рецепты медиа и буферов.
| 1. 500 мл массы BMDM+Pen-Strep (фильтр стерилизирован): | |
| Модифицированный Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco | 235 мл |
| Сыворотка плода быка (FBS) (инактивирована 30 минут при 54 °C) | 100 мл |
| Макрофаговый колони-стимулирующий фактор или M-CSF (среда с L-929) | 150 мл |
| Глутамин | 5 мл |
| Пируват натрия | 5 мл |
| β-меркаптоэтанол | 0,5 мл |
| Пенициллин/стрептомицин | 5 мл |
| Total | 500 мл |
| 2. 500 мл BMDM (фильтр стерилизирован): | |
| DMEM | 235 мл |
| FBS (выведена из эксплуатации через 30 минут при 54 °C) | 100 мл |
| M-CSF (среда с кондиционированным L-929) | 150 мл |
| Глутамин | 5 мл |
| Пируват натрия | 5 мл |
| β-меркаптоэтанол | 0,5 мл |
| Total | 500 мл |
| 3. Буфер AE | |
| Ацетат натрия (NaOAc) pH 5,2 | 50 мМ |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | 10 мМ |
| Вода без РНазы | |
| 4. фенол-хлороформ-IAA | |
| Фенол | 25 мл |
| Хлороформ | 24 мл |
| Изо-амиловый спирт | 1 мл |
| 5. хлороформ-IAA | |
| Хлороформ | 24 мл |
| Изо-амиловый спирт | 1 мл |