Выделение внутриклеточных патогенных бактерий из инфицированных клеток хозяина

Аннотация

Источник: Сигал, Н. и др. Очистка РНК из внутриклеточно выращенной Listeria monocytogenes в макрофаговых клетках. J. Vis. Exp. (2016).

В этом видео демонстрируется выделение внутренне патогенных бактерий из инфицированных макрофагов, полученных из костного мозга (BMDM). Бактерии могут прикрепиться к клеткам хозяина, а не прикреплённые бактерии смываются. После интернализации добавляется антибиотик для уничтожения неинтернализированных бактерий. Клетки-хозяины лизуются, центрифугуют, а супернатант фильтруется для захвата бактерий на фильтрующей бумаге, которая быстро замораживается и сохраняется для дальнейшего использования.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: В течение всего эксперимента клетки макрофагов инкубируются при 37 °C в инкубаторе с принудительным воздушным содержанием 5%_CO2 и выводятся из инкубатора только для экспериментальных работ, которые проводятся в биологическом защитном шкафу класса II. Работа с бактериями Listeria monocytogenes соответствует требованиям биологического уровня безопасности 2.

1. Подготовка клеток и бактериальная инфекция (дни 1 и 2)

1. День 1
   1. Семена 2,0 x 10⁷ макрофаговых клеток, полученных из костного мозга (BMDM) на тарелке диаметром 145 мм в среде 30 мл BMDM + Pen-Strep (Таблица 2). Семя — 3 пластины для каждого бактериального штамма, который будет анализироваться. Инкубировать ночь при 37 °C в инкубаторе с принудительным воздушным давлением 5%_CO2 .
   2. Начните ночную бактериальную культуру дикого типа (WT) штамма L. monocytogenes 10403S в 10 мл среды для инфузии мозга-сердца (BHI) при 30 °C в стандартном инкубаторе. Размещайте культурные трубки наклонными, не дрожащие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти условия роста повышают экспрессию генов жгутиков, что способствует эффективной инфекции.
2. День 2
   1. Предварительное разогревающее средство BMDM (без антибиотиков Pen-Strep) (Таблица 2) и фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) при 37 °C.
   2. Промыйте монослой макрофага дважды с помощью 25 мл предварительно подогреного PBS для удаления антибиотиков. Добавьте 30 мл свежего BMDM среднего масла.
   3. Промыть 1,5 мл ночной бактериальной культуры с PBS, центрифугировав бактерии в > 14 000 x g в течение 1 минуты, выбросить супернатант и аккуратно восстановить бактерии в 1,5 мл PBS с помощью пипетирования. Повторите дважды.
   4. Инфицировать каждую макрофаговую пластину 0,5 мл ночной культуры дикого типа L. monocytogenes. Если используете несколько пластин, инфицируйте каждую пластину с интервалом в 15 минут. Этот промежуток времени позволит собирать каждую тарелку отдельно в конце инфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Множественность инфекции (МОИ) измеряется путём серийного разбавления бактериальных культур, используемых для заражения, на агарных пластинах BHI, и подсчёта колониообразующих единиц (CFU) после 24-часовой инкубации пластин при 37 °C. Использование 0,5 мл штамма WT L. monocytogenes 10403S даёт MOI ~ 100 (100 бактерий КФУ на макрофаговую клетку). При анализе бактериальных мутантов, дефектных в внутриклеточном росте, следует учитывать более высокий MOI.
   5. После инкубации в течение 0,5 часов при 37 °C промыйте инфицированные клетки дважды PBS, чтобы удалить отделённые бактерии, и добавьте 30 мл предварительно нагретой среды BMDM. Прикреплённые бактерии интернализируются в течение следующих 0,5 часа.
   6. Через 1 час после заражения добавьте 30 мкл гентамицина (1:1 000 для достижения конечной концентрации 50 мкг/мл) для уничтожения внеклеточных бактерий.
   7. Собрать фильтрующий аппарат, разместив фильтрующую головку на колбу для сбора жидкости с вакуумным выходом. Затем разместить фильтр (0,45 мкм) на головку фильтра, затем воронку цилиндра и закрепить разные части металлическим зажимом. Приготовьте ледяную воду без РНаз.
   8. Через 6 часов после заражения извлекайте бактерии из заражённых клеток следующим образом. Обрабатывайте каждую тарелку индивидуально.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно L. monocytogenes завершает 1-лог роста в течение 6 часов инфекции в макрофаговых клетках. Более длительные инкубации могут привести к чрезмерному росту бактерий и гибели макрофагов клеток, тогда как короткие инкубационные периоды могут привести к значительно снижению бактериальной нагрузки. МОИ и время заражения могут быть изменены для достижения оптимальных условий.
      1. Один раз промывайте заражённые клетки PBS. Добавьте 20 мл ледяной воды без РНаз, чтобы лизировать макрофаговые клетки. С помощью скребка клетки быстро, но аккуратно соскребли клетки с пластины.
      2. Соберите лизированные клетки в коническую трубку объемом 50 мл. Вихрь на 30 секунд. Центрифугу при 800 x g в течение 3 минут при 4 °C.
      3. Пропустите супернатант через фильтрующий аппарат с помощью вакуумной системы. С помощью пинцета скрутите фильтр и быстро перенесите его в коническую трубку объемом 15 мл. Заморозьте трубки с фильтрами в жидком азоте.
      4. Соберите фильтрационный аппарат с новым фильтром для следующего образца, как описано в 1.2.7.
      5. Замороженные фильтры храните при -80 °C на следующий день. Или напрямую перейти к экстракции нуклеиновых кислот.

Таблица 1: Протокол реакции DNase.

РНК	до 2 мкг (в максимальном объёме 44 мкл)
Буфер 10x DNase	5 мкл
Вода без РНазы	полный объём до 50 мкл
DNAse	1 мкл (1 единица)

Таблица 2: Рецепты медиа и буферов.

1. 500 мл массы BMDM+Pen-Strep (фильтр стерилизирован):
Модифицированный Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco	235 мл
Сыворотка плода быка (FBS) (инактивирована 30 минут при 54 °C)	100 мл
Макрофаговый колони-стимулирующий фактор или M-CSF (среда с L-929)	150 мл
Глутамин	5 мл
Пируват натрия	5 мл
β-меркаптоэтанол	0,5 мл
Пенициллин/стрептомицин	5 мл
Total	500 мл
2. 500 мл BMDM (фильтр стерилизирован):
DMEM	235 мл
FBS (выведена из эксплуатации через 30 минут при 54 °C)	100 мл
M-CSF (среда с кондиционированным L-929)	150 мл
Глутамин	5 мл
Пируват натрия	5 мл
β-меркаптоэтанол	0,5 мл
Total	500 мл
3. Буфер AE
Ацетат натрия (NaOAc) pH 5,2	50 мМ
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	10 мМ
Вода без РНазы
4. фенол-хлороформ-IAA
Фенол	25 мл
Хлороформ	24 мл
Изо-амиловый спирт	1 мл
5. хлороформ-IAA
Хлороформ	24 мл
Изо-амиловый спирт	1 мл

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Listeria monocytogenes 10403S
Макрофаги, полученные из костного мозга, полученные у самок мышей C57B/6
H₂O, без РНК	Thermo Scientific	10977-015	Можно использовать воду, обработанную DEPC
DMEM	Gibco	41965039
Глутамин	Gibco	25030081
Пируват натрия	Gibco	11360-088
β-меркаптоэтанол	Gibco	31350010
Пен/стрептококк	Gibco	15140-122
Гентамицин	Сигма-Олдрич	G1397
FBS	Gibco	10270106
Фосфатный буферный раствор Dulbecco — PBS	Сигма-Олдрич	D8537
Инфузия мозгового сердца (BHI)	Меркмиллипор	1104930500
Ацетат натрия	Сигма-Олдрич	W302406
EDTA	Сигма-Олдрич	EDS
Этанол абсолют	Мерк Миллипор	1070174000
Инкубатор с принудительным воздушным давлением 37 °C, 5% CO₂	Thermo Scientific	Модель 3111
Скребки для ячейки	Нунк	179693
Стеклодержатель Kontes для фильтров 45 мм	Фишер	K953755-0045
MF-Millipore фильтры 45 мм, 0,45 мкм	Мерк Миллипор	HAWP04700
Система SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Научные отрасли	Модель G560E
Антенны для клеточной культуры диаметром 145 мм	Грейнер	639 160
1,7 мл пробирки, без РНазы	Axygen	MCT-175-C
Настольная центрифуга при температуре 4 °C	Эппендорф	5417R
Стерильные пипетки, 25 мл	Грейнер
Трубки Falcon, 50 мл	Грейнер