Экстракция РНК из Listeria monocytogenes , собранная из инфицированных мышиных макрофагов

Аннотация

Источник: Сигал, Н. и др. Очистка РНК из внутриклеточно выращенной Listeria monocytogenes в макрофаговых клетках. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео демонстрируется экстракция РНК из Listeria monocytogenes, выделенной из инфицированных мышиных макрофагов. Протокол сохраняет РНК, лизирует клетки с помощью фенол-хлороформ и тепла, а также отделяет РНК центрифугированием. Соль и этанол в сочетании с холодной инкубацией способствуют образованию РНК-осадков. Полученная РНК фиксирует экспрессию генов, индуцированную хозяином, раскрывая бактериальную вирулентность и стратегии адаптации.

Протокол

1. Экстракция нуклеиновых кислот

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все манипуляции с помощью растворов фенолов и хлороформов в выхлопной вытяжке.

1. Приготовьте смесь 1:1 подкисленного фенола: хлороформ, 400 мкл на каждый образец. Смешивайте в отдельных трубках, а затем аспирируете полученный водный слой. Добавьте 40 мкл 10% SDS.
2. Разморозьте трубки с фильтром на льду, чтобы они оставались холодными. К каждой фильтрующей трубке добавьте 650 мкл буфера ацетат-ЭДТА (AE) (50 мМ NaOAc, pH 5,2, 10 мМ EDTA, воды без РНаз).
3. Выполните следующие шаги как можно быстрее.
   1. Энергично закрутите трубку с фильтром так, чтобы фильтр переместился к краю трубки, и буфер полностью промыл фильтр. Всегда держите трубку холодной, положив её обратно на лёд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется дополнительно выхватить трубку в перевёрнутом положении, чтобы полностью смыть бактерии с фильтра.
   2. Повторяйте для всех трубок. Возможно, будет полезно быстро уменьшить вращение подвески (1 минута при 120 x g) в конце процесса.
4. Переместить буфер, содержащий бактерии, в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл с смесью SDS и фенол/хлороформ. Повторяйте для всех трубок. Возможно, потребуется снова прокрутить фильтр с трубками (1 минута при 120 x g), чтобы получить остаточный буфер от фильтра.
5. Поместите все пробирки по 1,5 мл в многотрубное вихревое устройство и используйте вихрь на полной скорости в течение 10 минут.
6. Инкубировать трубки в нагревательном блоке при температуре 65 °C в течение 10 минут. Центрифуга на максимальной скорости (> 14 000 x g) в течение 5 минут.
7. Перенесите водный слой (около 400 мкл) из каждой трубки в новую трубку объемом 1,5 мл, содержащую 40 мкл 3 м ацетата натрия (pH 5,2) и 1,0 мл 100% этанола. Тщательно закрутите каждую трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно добавить гликоген для улучшения визуализации осаждённой гранулы.
8. Инкубировать образцы при -80 °C в течение 1 часа. В качестве альтернативы инкубировать образцы при -20 °C ночью. Затем центрифугайте образцы при 4 °C в течение 20 минут на максимальной скорости (> 14 000 x g).
9. Аккуратно аспирируйте этанол (верхний слой) из каждой трубки. Добавьте 500 мкл холодного этанола 70% в каждый образец и тщательно обработайте вихрь. Центрифуга при 4 °C в течение 20 минут на максимальной скорости (> 1 4 000 x g).
10. Аккуратно аспирируйте этанол из каждой трубки. Сушите образцы примерно 2 минуты с помощью вакуумного испарителя без нагрева. Не пересушите образцы.
11. Добавьте в каждый образец 25 мкл воды без РНаз. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Аккуратно вихрь и вращение вниз.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Listeria monocytogenes 10403S
H2O, без РНК	Thermo Scientific	10977-015	Можно использовать воду, обработанную DEPC
pH насыщенного фенолом 4,3	Фишер	BP1751I-400
Хлороформ	Фишер	BP1145-1
Изо-амиловый спирт	Сигма-Олдрич	W205702
Ацетат натрия	Сигма-Олдрич	W302406
EDTA	Сигма-Олдрич	EDS
SDS 10%	Сигма-Олдрич	L4522
Этанол абсолют	Мерк Миллипор	1070174000
MF-Millipore фильтры 45 мм, 0,45 мкм	Мерк Миллипор	HAWP04700
Vortex-Genie 2	Научные отрасли	Модель G560E
65 °C тепловой блок	Thermo Scientific
Настольная центрифуга при температуре 4 °C	Эппендорф	5417R
Стерильные пипетки, 25 мл	Грейнер
Трубки Falcon, 50 мл	Грейнер
1,7 мл пробирки, без РНазы	Axygen	MCT-175-C
Система SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA