$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Подготовка бактериального инокулума для уропатогенного Escherichia coli (UPEC)
- Подготовьте инфекции мочевыводящих путей89 (UTI89) инокуляцию (начинайте за 72 часа до дня прививки)
- Полоса UTI89 на агарную пластину LB (Лурия-Бертани) из замороженного запаса. Инкубировать на ночь при 37 °C. Выбрать колонию и засыпать её в 10 мл LB в колбу на 125 мл. Инкубировать при 37 °C в течение 24 часов, статически.
- Инокулировать 10 мкл ночной культуры в 10 мл LB в новой колбе объемом 125 мл на дополнительные 24 часа при 37 °C, статически.
- Переведите 3 мл (зависит от деформации и желаемого размера инокулума) в стерильные пробирки объёмом 1,5 мл и центрифугу при 7 000 x г в течение 3 минут, затем снова суспензуйте гранулу в 1x фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) и центрифугуйте второй раз. Суспензировать бактериальную гранулу в 1 мл 1x PBS.
- Измеряйте оптическую плотность бактерий и регулируйте концентрацию до желаемой плотности инокуля. Стандартная концентрация используемого инокулюма составляет 107 бактерий; однако это может варьироваться в зависимости от дизайна исследования.
2. Бактериальная инокуляция
- Очистите рабочее место 70% этанолом и закройте область впитывающей бумагой (или используйте стерильный протяжной капюшон).
- До 0,9 мл подготовленного бактериального инокулума введите в шприц с туберкулином (ТБ) объемом 1 мл (удалите пузырьки воздуха). Прикрепите подготовленную стерильную иглу для инокуляции с полиэтиленом с трубкой размером 10 (PE10) к шприцу, содержащему инокулум, затем стерильно обрезайте полиэтиленовую трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте 1 мм трубки над кончиком иглы, чтобы избежать прокола мочевого пузыря. - Вырежьте квадратный кусок парапленки размером 1 дюйм и нанесите сверху хирургическую смазку (примерно размером с десять центов).
- Анестезируйте самок мышей C3H/HeN, помещая их в камеру испарителя (согласно производственному протоколу) до потери сознания, но дыхания нормально (1 вдох/сек).
ВНИМАНИЕ: Изофлуран — это ингаляционный анестетик. Используйте в хорошо проветриваемом помещении и минимизируйте вдыхание. - Выньте мышь из вапорайзера, положите её на спину на бумажное полотенце и раздвините ножки.
- Накройте нос мыши носовым конусом (трубкой, соединённой с вапорайзером, обеспечивающей контролируемую дозу изофлурана, установленной в некоторых вапорайзерах) для поддержания анестезии.
- Аккуратно пробуй мочевой пузырь, чтобы вызвать мочеиспускание и убедиться, что мочевой пузырь опорожнен. Протри периуретральную область салфеткой с 100% этанолом. Втирайте иглу/шприц для инокуляции, направляя вперёд, в хирургическую смазку.
- Инокуляция каждой мыши 50 мкл бактериального раствора, вводя иглу для инокуляции трансуретрально, примерно на 12 мм, и мягко нажимая на поршень шприца, чтобы ввести инокулум в мочевой пузырь (10 мкл/сек). Уберите иглу для прививки с мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мгновенное возвращение инокулума в уретральное отверстие при начале инокуляции указывает на неправильное или неполное введение иглы. - Вынимите мышь из носового конуса и верните её в клетку. Повторяйте шаги 2.3-2.8 для каждой мыши. При смене условий/сортов инокуля выбросьте шприц и иглу в одобренный контейнер для острых предметов и начните заново с шага 2.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прививка уропатогенными организмами обычно не вызывает сильных болевых симптомов. Однако в редких случаях введение больших доз патогенов может вызвать лихорадку, снижение потребления пищи и воды, а также аномальное поведение. Здоровье животных следует контролировать на протяжении всего эксперимента. Если заметны явные болевые симптомы, можно нанести обезболивающее, например бупренорфин (0,05−0,1 мг/кг, введённый подкожно).
3. Перепись внутриклеточных бактериальных сообществ (IBC)
- Асептически удалите мочевой пузырь и поместите его в 1x PBS в пластину на 6 ямок с силиконовым дном. Пластины можно подготовить с помощью набора силиконового эластомера и заливать примерно 1 см силикона в каждую яму. Разрежьте мочевой пузырь пополам ножницами.
- С помощью маленьких металлических штифтов аккуратно разведите мочевой пузырь так, чтобы просвет мочевого пузыря был обращён вверх. Обязательно разместите штифты на самых крайних краях секций мочевого пузыря, чтобы максимально открыто количество уротелия.
- После расщепления аккуратно промыйте мочевой пузырь один раз с помощью PBS. Удалите 1x PBS с помощью пипетки. Исправьте мочевой пузырь, добавив достаточно 3% параформальдегида, чтобы покрыть весь расставленный пузырь.
ВНИМАНИЕ: Параформальдегид канцерогенен. Соответствующее защитное снаряжение, включая перчатки, следует носить постоянно. Утилизация должна следовать институциональным рекомендациям. - Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа. Удалите параформальдегидный раствор. Постирайте один раз с помощью 1x PBS.
- Промывайте раствором LacZ (2 мМ MgCl2, 0,01% натрия дезоксихолата и 0,02% нонидет-p40 в 1x PBS) три раза по 5 минут за одну промывку.
- Удалите раствор для стирки и добавьте достаточно морилки LacZ (раствор LacZ, 0,4 мл 25 мг/мл X-галон и 0,1 мл 100 мМ K-ферроцианида/K-феррицанида), чтобы покрыть мочевой пузырь. Инкубировать при 30 °C ночью, защищаясь от света.
- Удалите расставленные мочевые пузыри из инкубатора и наблюдайте за IBC, которые выглядят синими пунктами при визуализации с помощью расщепы, увеличение 40-60 раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда мышь может помочиться до размещения трубки под уретру. В этом случае подождите 15-20 минут, прежде чем снова пытаться собрать мочу.