Биолюминесцентная визуализация ожогов от зараженных Acinetobacter baumannii у мышей

Аннотация

Источник: Wang, Y. и др. In vivo Исследование антимикробной терапии синим светом при мультирезистентных ожоговых инфекциях Acinetobacter baumannii с использованием биолюминесцентной визуализации. J. Vis. Exp . (2017)

В этом видео демонстрируется процедура визуализации ожоговых ран у мышей, вакцинированных Acinetobacter baumannii с биолюминесцентным опероном. В ней показано, как окисление субстрата, катализируемое люциферазой, производит свет, пропорциональный нагрузке бактерий, что позволяет отслеживать прогрессирование инфекции в реальном времени с помощью системы биолюминесценци.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Биолюминесцентная визуализация инфекций у мышей

1. Сфотографируйте мышей с помощью системы съёмки при слабом освещении, включающей камеру с усиленным зарядом, контроллер камеры, камеру для образцов и процессор изображений.
2. Анестезия мышей с помощью внутрибрюшинной инъекции коктейля кетамина и ксилазина (100 мг/кг - 20 мг/кг). Легко коснитесь пальпебрального пальца мышей ватной палочкой; отсутствие пальпебрального рефлекса указывает на соответствующую глубину анестезии.
3. Запустите программное обеспечение для живых изображений. В панели управления нажмите «Инициализировать». Дождитесь, пока цвет температурного блока не станет зелёным, что означает, что температура ступени в камере образца достигла 37 °C.
4. Поместить мышей на сцену (37 °C) в камеру для образцов системы визуализации, при этом инфицированные ожоги опустятся непосредственно под камеру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биолюминесценция бактерий может снижаться, когда ожоги становятся сухими. Поэтому рекомендуется увлажнять ожоги мышей с помощью PBS перед проведением визуализации.
5. В панели управления поставьте галочку рядом с «Люминесценция». Выберите «Автоэкспозиция», чтобы время экспозиции было оптимизировано программным обеспечением для живой визуализации на основе интенсивности биолюминесценции.
6. Выберите «C» из выпадающего списка «Поле зрения». Выберите опцию «Сканировать средний диапазон», чтобы программное обеспечение определило фокусное расстояние. Поставьте галочку рядом с Overlay.
7. Нажмите «Приобрести», чтобы запечатлеть изображение. В поле «Редактировать метку изображения» нажмите «OK»; появится «Окно изображения» и «Палитра оплаты».
8. Установите параметры Auto ROI для автовыбора.
9. Количественно определить интенсивность биолюминесценции в виде единиц относительной люминесценции (RLU) и отобрать биолюминесценцию в шкале ложного цвета от розового (наиболее интенсивного) до синего (наименее интенсивного).
10. Рассчитайте долю выживаемости бактерий в мышиных ожогах в разные временные моменты на основе анализа интенсивности биолюминесценции. Доля выживаемости бактерий в определённую временную точку = интенсивность биолюминесценции, измеренная в этот момент / интенсивность биолюминесценции, измеренная непосредственно перед воздействием антимикробного синего света.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
IVIS	PerkinElmer Inc, Уолтем, Массачусетс	IVIS Lumina серии III	Доклиническая in vivo визуализация
Светодиод с светодиодом с излучающим светом	VieLight Inc, Торонто, Канада	415 морских миль	Источник света для освещения
Мышь	Лаборатории Чарльза Ривер, Уилмингтон, Массачусетс	BALB/c	7-8 недель, вес 17-19 г
Acinetobacter baumannii	Армейский медицинский центр Брук, Форт Сэм Хьюстон, Техас	Клинический изолят	Инженерная люминесцентная деформация
Блюда Грейнера	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 мм ×10 мм