Доставка рекомбинантных вирусных клонов через агробактерии в сеянцы кукурузы для генного заглушания

Аннотация

Источник: Бирнинк, Б. М . и др. Прямая агроинокуляция сеянцев кукурузы путём инъекции рекомбинантных вирусов мозаики лисохвоста и вируса мозаики сахарного тростника. J. Vis. Exp . (2021)

В этом видео демонстрируется передача рекомбинантных вирусных клонов через Agrobacterium в сеянцы кукурузы для заглушания генов. В ней описывается процесс заражения агробактериями , системного распространения вирусов и фенотипических изменений, вызванных интерференцией РНК.

Протокол

1. Инъекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Семена кукурузы возрастом от 4 до 7 дней можно использовать для инъекций. Скорость роста рассад сильно зависит от условий роста, количества фотосинтетически активного излучения (PAR) (то есть выше PAR в теплице, чем в камере роста) и генотипа, а также других факторов, которые могут быть трудно контролировать в парниковых условиях. Растения можно инъекциировать уже в возрасте 4 дней, когда они достигают 2-3 см в высоту и без распущенных листьев, и до 7 дней, когда нижний округлый лист распущен. Успех этого метода инокуляции резко снижается по мере старения растений более 7 дней после посева. Место инъекции одинаково независимо от возраста саженцев.

1. Надевая защитные очки, введите бактериальную суспензию в проростки на 2-3 мм выше колеоптилярного узла с помощью иглы размером 25G x 5/8", прикреплённой к одноразовому шприцу объёмом 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Колеоптилярный узел — это место, где в конечном итоге формируются корни коронки. Это самый низкий узел на установке. Обычно цвет меняется с зелёного на белый в узле и ниже узла. Место инъекции находится чуть выше меристемы. Вскрытие нескольких сеянцев на этом этапе может помочь визуализировать расположение меристемы и, соответственно, правильное место инъекции.
2. Аккуратно давите на шприц, пока суспензия не заполнит колеоптил или не станет видна в мутовке, в зависимости от стадии роста растений. Это примерно 100–200 мкл суспензии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если ввести суспензию в саженец сложно, место инъекции может быть слишком низким. Достаточно умеренного давления для впрыска подвески.
3. Вводите все всады, меняя шприцы и иглы для каждой конструкции.

2. Постоянный уход за растениями

1. Пересаживайте инъекционные всады в горшки размером 13 x 13 x 15 см и больше, когда им исполнится 7-8 дней.
2. Поддерживайте условия роста (16 часов фотопериода и удобрение раз в неделю).

3. Подтверждение инфекции (фенотипически)

1. Фенотипически оценивают растения в период от 14 до 21 дня после инокуляции (DPI). Поражения, вызванные заглушанием контрольных генов, мимикующих 22 или фитоновой десатуразы , легко заметны на листьях, и они отличаются от симптомов FoMV.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шприцы объёмом 1 мл	Fisher Scientific	14955450	альтернативно, BD 309659
Агробактерия tumefaciens, штамм GV3101			Несёт аппарат для передачи T-ДНК с кодированием vir плазмид, RifR, GmR, из лабораторных запасов
Удобрения			Peters Fertilizer 15-15-15 Концентрат
Большие горшки	Кордлок	SQL0550	5x5x4" или больше. Для пересадки всады.
Кукурузный золотой бантам и сладкая кукуруза	Американские луга, семена западного побережья
Почвенный субстрат	Садоводство SunGro	SS#1-F1P	Sunshine Mix #1/Fafard-1P, достаточно любой почвенной смеси, в которой кукуруза хорошо растёт.