Установление биопленок между бактериями и грибами для изучения патогенеза полости рта

Аннотация

Источник: Schlafer, S, и Frost Kristensen, M. Мониторинг внеклеточного pH в биопленках Cross-Kingdom с использованием конфокальной микроскопии. J. Vis. Exp . (2020)

В этом видео демонстрируется культивирование биопленок Streptococcus mutans mutans и Candida albicans в межцарственных биопленках в условиях, подобных пероральным, для моделирования бактериально-грибковых взаимодействий, что позволяет изучать микробную синергию, адгезию, опосредованную глюканом, и ацидогенную вирулентность в оральной патогенезе.

Протокол

Все процедуры, связанные с сбором образцов, были выполнены в соответствии с руководящими принципами института IRB.

1. Культивация биопленок между королевствами

1. Выращивать Streptococcus mutans (S. mutans) DSM 20523 и Candida albicans (C. albicans) NCPF 3179 на кровяных агарных пластинах при 37 °C в аэробных условиях.
2. Переносите отдельные колонии каждого организма в пробирки, заполненные 5 мл инфузии мозга-сердца (BHI). Выращивайте 18 часов в аэробных условиях при 37 °C.
3. Центрифугуйте ночные культуры при 1200 г в течение 5 минут. Отбросьте супернатант, снова суспензируйте клетки в физиологическом физиологическом растворе и отрегулируйте_{OD 550 нм} до 0,5 для C. albicans (~10⁷ клеток/мл) и S. mutans (~10⁸ клеток/мл). Разведите суспензию S. mutans в 1:10 стерильным физиологическим раствором (~10⁷ клеток/мл).
4. Пипетта 50 мкл стерильного слюнного раствора в колодцы оптической нижней пластины с 96 лунками для микроскопии. Инкубировать 30 минут при 37 °C. Промой колодцы три раза 100 мкл стерильного физиологического раствора. Опустошите колодцы.
5. Добавьте 100 мкл суспензии C. albicans в каждую скважину. Инкубировать при 37 °C в течение 90 минут. Промыйте три раза стерильным физиологическим раствором.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не опустошайте колодцы полностью во время мойки. Оставьте резервуар объёмом 20 мкл, чтобы избежать чрезмерных сдвиговых сил.
6. Добавьте в каждую колодцу 100 мкл тепловой инактивированной сыворотки плода крупного рогатого скота (инактивированной при 56 °C в течение 30 минут). Инкубировать при 37 °C в течение 2 часов. Промыйте три раза стерильным физиологическим раствором. Опустошите скважины, оставив резервуар объёмом 20 мкл.
7. Добавьте 100 мкл суспензии S. mutans (подготовленной на шаге 1.3) в каждую яму. Добавьте 150 мкл BHI, содержащего 5% сахарозы. Инкубировать при 37 °C в течение 24 часов или дольше. При культивировании старых биопленок ежедневно меняйте среду на свежую BHI. В конце фазы роста биопленки между царствами промывайте 5 раз стерильным физиологическим раствором.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кровавые агарные пластины	Сывороточный институт Стейтенса	677
Инфузия мозга-сердца	Оксоид	CM1135
Инфузия в мозг, сердце + 5 % сахарозы	Лабораторные материалы BDH	10274
Candida albicans	Национальная коллекция патогенных грибов	NCPF 3179
Сыворотка плода крупного рогатого скота	Технологии Gibco Life	10270
Рефрижераторная центрифуга GS-6R	Бекман	Н/Д
μ-Пластина 96 Колодец Блэк	Ибиди	89626
Стерильный физиологический раствор	VWR	6404
Streptococcus mutans	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 20523
Визонспектрофотометр V-3000PC	VWR	Н/Д