$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Приготовление кремниевой пластины
- Спроектировать геометрию микрофлюидного канала в программном обеспечении с автоматизированным проектированием (CAD; см. Таблицу материалов) и напечатать её на прозрачной плёнке для создания фотомаски (рисунок 1A).
- Изготовление главной формы методом мягкой литографии (в условиях чистой комнаты), следуя следующим следующим шагам.
- Запекайте кремниевую пластину при 200 °C в течение 2 часов.
- Поставьте пластину в центр спин-коутера и налейте фоторезист SU8 3050 (см. таблицу материалов) на пластину. Наносите слой на 1700 об/мин в течение 40 секунд с темпом 10 с/100 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры спин-покрытия были установлены так, чтобы получить целевую толщину 100 мкм для SU8 3050. - После процесса вращенного покрытия мягко запекайте кремниевую пластину при температуре 65 °C в течение 600 с и 95 °C в течение 2 700 с. Дайте вафле остыть при комнатной температуре на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ночное охлаждение улучшает сцепление SU8 с пластиной. - Наместите фотомаску (шаг 1.1) на пластину и подвергите её воздействию ультрафиолетового света с энергией экспозиции 250 мДж/см² и длиной волны 350 нм.
- После экспозиции запекайте открытый субстрат при 65 °C в течение 60 с и 95 °C в течение 300 с.
- Проявляйте кремниевую пластину для получения мастер-формы, погружая её в стакан, заполненный проявителем mrDev600 (см. Таблицу материалов). Аккуратно встряхните стакан 1800 секунд, чтобы смыть неполимеризированный резист. Затем используйте разбрызгивающую промывку, распылив изопропанол на кремниевую пластину, и сушите на воздухе.
- Запекайте кремниевую пластину при 200 °C в течение 1800 секунд.
- Силанизуйте главную форму с помощью парового осаджения 20 мкл трихлора (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил) (см. таблицу материалов), размещённого на стеклянном затворе рядом с формой на 40 минут в вакуумном десикаторе, создавая манометрическое давление 100 мбар.
2. Изготовление микрофлюидного устройства
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная здесь процедура изготовления предназначена для микрофлюидного устройства с одним микрофлюидным каналом. Однако тот же метод можно применить для изготовления микрофлюидного устройства с несколькими микрофлюидными каналами параллельно.
- Смешайте эластомер с его сшивателем в соотношении 10:1 (см. Таблицу материалов), чтобы получить смесь полидиметилсилоксана (PDMS). Перемешайте смесь, пока она не станет равномерно смешанной и не станет непрозрачной из-за замкнутых пузырьков воздуха.
- Дегаз смеси в вакуумном десикаторе, создавая манометрическое давление 100 мбар, пока захваченные пузырьки воздуха не будут удалены, и она не станет прозрачной. Время, необходимое для дегазации, обычно составляет 30 минут.
- Поместите главную форму (шаг 1) в контейнер для клеточной культуры (см. таблицу материалов). Залить 20 г смеси PDMS на основную форму, чтобы получить каналы с конечной толщиной 5 мм.
- Выпекайте главную форму при 70 °C в течение 2 часов.
- Разрежьте отвергнутый PDMS вокруг микрофлюидного канала (примерно 3 мм) лезвием, а затем откройте микрофлюидный канал PDMS с основной формы.
- Для создания входа и выхода микрофлюидных каналов проколовите отверстия биопсийным пуншом (диаметром 1,5 мм) на их концах (верхняя часть треугольников, см. рисунок 1A). Пробьите ещё одно отверстие в центре входного треугольника, чтобы позже установить датчик давления.
- Промой стеклянное стекло и микрофлюидный канал коммерчески доступным раствором 1% моющего средства (см. таблицу материалов) в течение 5 минут, затем прополосните их деионизированной водой. После этого промыйте микрофлюидный канал PDMS и стеклянное стекло изопропанолом. Затем снова прополосните их деионизированной водой. Сушите микрофлюидный канал PDMS и стеклянный затвор с сжатым воздухом при 1 бар в течение 1 минуты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пористая структура PDMS должна быть полностью сухой для эффективного соединения. - Поместите стекло и микрофлюидный канал в плазменный очиститель (см. Таблицу материалов) и убедитесь, что поверхности для соединения расположены вверх. Включите очиститель плазмы и обработайте микрофлюидный канал и стеклянное стекло воздушной плазмой с потоком воздуха 1 SL/ч (стандартный литр в час) в течение 1 минуты. Сразу после извлечения из очистителя подключите микрофлюидный канал к стеклянному стеклу, соприкоснув их друг с другом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не трогайте обработанные поверхности, так как это может повлиять на сцепление. При изготовлении микрофлюидного устройства с несколькими микрофлюидными каналами одновременно экспонируйте микрофлюидные каналы и соединяйте их одним шагом. - Поставьте склеенное микрофлюидное устройство на плиту при температуре 80 °C минимум на 15 минут.
- Храните микрофлюидное устройство в чистой контейнере для клеточной культуры до начала эксперимента.
3. Подготовка бактериальной суспензии
- Выращивать популяцию Bacillus subtilis NCIB 3610 в течение 20 часов перед началом эксперимента, напрямую инокуляцируя 3 мл питательного бульона No3 из культурной среды (см. таблицу материалов) из замороженного глицеролового запаса в пробирке объемом 15 мл. Инкубировать в встряхивающем инкубаторе при 30 °C и 200 об/мин ночью (16 часов).
- Создайте субкультуру из ночной культуры за 4 часа до начала эксперимента, добавив 3 мкл ночной культуры в 3 мл свежей культуры (разбавление 1:1 000) в пробирку объемом 15 мл. Инкубировать субкультуру в трясущем инкубаторе при 30 °C при 200 об/мин в течение 3,5–4 часа, чтобы получить оптическую плотность при 600 нм (OD₆₀₀) равную 0,1.
4. Эксперимент по росту биопленки
- Включите инкубатор микроскопа за 3 часа до эксперимента, чтобы обеспечить стабильную температуру 25 °C. Установьте шприцовый насос и датчики давления (см. таблицу материалов).
- Подключите впускную и выходную трубку к микрофлюидному устройству. Напрямую введите иглу (с внешним диаметром 0,6 мм) в впускную трубку, чтобы закрепить соединение между трубкой и шприцем.
- Поместите микрофлюидное устройство, 30 мл деионизированной воды и 30 мл культурной среды в вакуумный осушитель и дегазируйте их не менее 1 часа. Затем медленно втяните посевную среду и деионизированную воду в два отдельных шприца по 30 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап крайне важен для предотвращения образования пузырьков в канале при промывке с культурной средой. - Установите микрофлюидное устройство на микроскоп и поместите выходную трубку в контейнер для отходов.
- Подключите шприц, наполненный деионизированной водой, к микрофлюидному каналу через микрофлюидную трубку и медленно вводите воду, пока она не выйдет из выхода датчика давления. Наполните датчик давления водой и промите все пузырьки из трубки, соединяющей микрофлюидный канал и датчик давления. Закройте выход датчика давления винтами, предназначенными для датчика давления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная процедура наполнения гарантирует, что изменения давления на входе микрофлюидических каналов будут точно фиксироваться. При проведении эксперимента с несколькими микрофлюидными каналами подключите каждый канал к отдельному шприцу для обеспечения одинаковых условий потока во всех каналах.
- Заполните остальную часть микрофлюидного канала деионизированной водой.
- Поместите фильтр 1,2 мкм (см. Таблицу материалов) на шприц с культурной средой. Затем снимите водяной шприц и аккуратно подключите шприц с посевной средой к входной микрофлюидической трубке. Закрепите шприц на насос и промыйте канал культурной средой при расходе 2 мл/ч в течение 1 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр предотвращает попадание бактериальных клеток в шприц во время загрузки. Промывка микрофлюидного канала культурной средой удаляет оставшиеся пузырьки в пористой структуре. - Во время эксперимента установите насос для шприца на желаемый расход (здесь 1 мл/ч) и установите давление датчиков на нуле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установив начальное значение давления на нуле, измеряется только разница давления, вызванная развитием биопленки во время эксперимента. - Пипетка 1 мл бактериальной культуры при OD₆₀₀ 0,1 в флакон центрифугы объемом 1,5 мл. Загрузите бактериальную культуру в микрофлюидный канал, поместив выходную трубку в флакон центрифуга. После ожидания 5 минут, чтобы удалить возможные воздушные пузырьки из выхода трубок, отнимите 150 мкл бактериального раствора со скоростью потока 1 мл/ч, пока микрофлюидный канал не заполнится бактериальной культурой.
- Аккуратно снимите фильтр для шприца и поставьте розетку в контейнер для отходов. Оставьте бактериальные клетки в условиях нулевого потока в микрофлюидном канале на 3 часа, чтобы обеспечить их поверхностное прикрепление в пористую среду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставление бактериальных клеток в условиях нулевого потока в течение 3 часов было оптимизировано для прикрепления используемого бактериального штамма при обеспечении хорошо насыщенной кислородом бактериальной культуры. Другие бактериальные штаммы могут потребовать больше или меньше времени. - Для начала эксперимента запустите поток, установив насос для шприца на желаемую скорость расхода (здесь 1 мл/ч) и измерив давление на 1 Гц.
- Получите изображения растущей биопленки с нужным временным интервалом, оптической конфигурацией и увеличением.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании изображения с увеличением в 4x в режиме яркого поля в 18 позициях, охватывающих всю область пористой среды, были получены каждые 6 минут в течение 24 часов.
