Микроскопическая оценка прикрепления бактерий к поверхности корней растений

Аннотация

Источник: Маттисс, А. Г. Прикрепление бактерий к поверхностям растений, измеряемое в лаборатории. J. Vis. Exp . (2018).

В этом видео демонстрируется оценка прикрепления бактерий к корням растений с помощью фазово-контрастной микроскопии. Для проверки свободных бактерий сначала устанавливают образцы корней из саженцев, высиживаемых бактериями. Затем образцы промываются для удаления слабо прикреплённых бактерий и устанавливаются с помощью подходящего накладного слоя для предотвращения повреждений. Наконец, под микроскопом подсчитывается количество бактерий, прикреплённых к корневым волоскам.

Протокол

1. Инокуляция бактерий

1. Определите количество бактерий, подлежащих вакцинации, исходя из измерения, используемого для определения адгезии бактерий и продолжительности времени инкубации.
2. Для микроскопических исследований с инкубационным временем менее 1 дня инокуляйте относительно большое количество бактерий. Добавьте количество культуры, чтобы получить итоговую бактериальную концентрацию более^10-6 бактерий на мл. Для более длительного времени инкубации уменьшайте размер бактериального инокуля.
3. Для исследований, в которых сцепление бактерий измеряется по жизнеспособным количеству клеток, добавьте количество культуры, чтобы достичь конечной концентрации бактерий от 10³ до 10⁶ бактерий на мл.
4. Избегайте добавления слишком большого количества бактерий, чтобы их метаболизм изменил pH или концентрацию кислорода в инкубационной среде. Измеряйте pH с помощью бумаги pH или электрода. Измеряйте концентрацию кислорода с помощью кислородного электрода.
5. Для растений, выращиваемых на песке, инокуляцию тремя возможными способами.
   1. Перед посадкой замочите семена бактериями, замачивая семена на 1 минуту в суспензии в воде примерно^10-6 бактерий на мл.
   2. Инокулируйте корень, прорастая аксенические всходы. Когда сеянец достигает длины около 1 см, окуньте его или поместите весь саженец в суспензию^10-6 бактерий на мл в воду на 1 минуту.
   3. Инокулируйте песок, смешав бактерии с песком перед посадкой, чтобы получить итоговую концентрацию около 10–³ бактерий на мл, или поливайте саженец с суспензией 10-6 бактерий на мл после посадки.

2. Инкубация бактерий с растительным материалом

1. Для инкубации в жидкой среде инкубировать бактерии с растительным материалом в стерильной воде или сахарозе и минеральных солях, либо в среде культуры растительной ткани (например, разбавление 1:10 базальной солиной Murashige и Skoog или солей MS).
   1. Используйте контейнер, к которому бактерии не прилипли. Старайтесь постоянно закрывать поверхность растения — либо погружением, либо мягким перемешиванием. Интенсивное перемешивание может предотвратить склеивание или даже удалить бактерии с поверхности растения.
   2. Наблюдайте растительный материал в световом микроскопе через разные временные интервалы, чтобы определить, когда остановить инкубацию и провести измерения. Временной курс спайки часто полезен: образцы берутся каждые 1–4 часа или каждый день, в зависимости от скорости взаимодействия.
2. Для инкубации в песке применяйте те же условия, что и для инкубации в жидкой среде на этапе 2.1.

3. Измерение адгезии с помощью микроскопии

1. Проводите микроскопические измерения с помощью оптики Номарского или фазово-контрастной оптики для удобного наблюдения бактерий на поверхностях. Однако можно использовать любой микроскоп с ярким полем с увеличением 20X и выше.
   1. Используйте микроскопическое наблюдение, чтобы определить, распределены ли бактерии случайным образом или расположены в определённых участках. Также проверьте, связаны ли они поодиночке или кластерами. Обратите внимание на наличие микроколоний, указывающих на развитие или захват бактерий после спайки. Проверьте, образуют ли бактерии биопленку на поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биопленка — это большое количество бактерий, связанных с поверхностью и окружённых внеклеточным матриксом. Структура может быть гладкой и однородной или иметь более сложную архитектуру.
   2. Используйте бактерии, помеченные флуоресцентным маркером. Если присутствуют другие бактерии и интересующие бактерии идентифицируются по флуоресцентной метке, такой как зелёный флуоресцентный белок (GFP), используйте флуоресцентную микроскопию для определения присутствия помеченных бактерий в кластерах других бактерий. Для GFP используйте фильтр с возбуждением 490 нм и излучением 520 нм.
      1. Проверьте, не влияет ли флуоресцентная метка на бактерии, наблюдая за присоединением к аксеническому материалу равной смеси диких и помеченных бактерий одного штамма с помощью оптики Номарского и флуоресцентной оптики. Если флуоресцентные и тёмные бактерии случайным образом смешаны и присутствуют в равных количествах, то метка не вмешалась в анализ.
2. Определите количество прикреплённых бактерий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень сложно определить количество прикреплённых бактерий в микроскопе. Когда связывание происходит с неровными поверхностями растений, обычно невозможно получить количественное измерение. Для проведения таких измерений может использоваться сканирующая электронная микроскопия (не обсуждаемая в этой статье).
   1. Когда бактерии связаны с гладкой поверхностью, такой как корневый волосок, подсчитайте количество бактерий, связанных с краем корневой волоски, на миллиметр длины корневого волоска. Обязательно используйте корневые волоски примерно одинакового размера и формы при сравнении размеров.
   2. Чтобы определить размер объектов в микроскопе, используйте коммерческий слайд с измеренными метками. Наблюдайте и фотографируйте этот слайд в тех же настройках, что и для экспериментального материала, и используйте полученные изображения для определения размера объектов на фотомикрофотографии.
3. Подготовьте образец для микроскопии.
   1. Помой образец. Переместите образец в каплю воды или инкубационной среды на стекле микроскопа и наблюдайте за ним напрямую.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это имеет преимущество в том, что если бы не было роста бактерий или фактической гибели, вряд ли было бы много свободных бактерий. Воспринимайте отсутствие свободных бактерий как предупреждающий признак того, что могла произойти гибель бактерий или связаться с контейнером, в котором проводилась инкубация. Эффект промывания образца показан на рисунке 1.
   2. Аккуратно промыйте образец в воде или инкубационном среде, поместив его в флакон с жидкостью и аккуратно перевернув флакон. Затем поместите образец на стекло микроскопа в свежую жидкость для наблюдения.
   3. Разместите образец в жидкости с помощью обычного крышного затвора и микроскопического стекла.
      1. Если образец толстый и создаёт выпуклость под скользящей крышкой, используйте скольжение с нажимом. Эти накладки имеют кольцо из резины или пластика по краю скольжения крышки. Поместите жидкость и образец в скважину в крышку, затем поставьте затвор сверху и аккуратно нажмите, чтобы запечатать крышку на затворе. Переверните и осмотрите.
      2. В качестве альтернативы используйте слайд для подсчёта водорослей и скольжение для покрытия аналогичным образом. Обратите внимание, что затворы с такой глубиной обычно нельзя рассматривать объективом с увеличением более 20 раз.

Результаты

Рисунок 1: Этапы подготовки образца для определения количества связанных бактерий. Agrobacterium tumefaciens связывается с волосками кореней томатов (A, B и C) и нейлоновым нитям (D, E и F). В образцах, помещённых в воду без промывки...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Световой микроскоп	любой	Н/Д	Функциональны фазово-контрастные или номарские оптики, для исследований с использованием флуоресцентных маркеров требуется флуоресцентный микроскоп.
Семена	любой	Н/Д	Запишите номер партии семян и сорт
Отбеливатель	любой	Н/Д
Ванный соникатор	Любая компания по научным снабжениям	Н/Д
Triton X-100	Сигма-Олдрич	T9284
Питательный агар	Difco	2001-01-08
Soytone	Difco	24360
Песок	морской песок Fisher Scientific	S25
Песок	Сигма-Олдрич	S9887
Контейнеры	Stuewe & Sons, Inc.	Конусообразные тенеры Рэя-Лича	Доступно множество различных размеров, подходящих для того типа растения, которое вы хотите выращивать
Парафильм	Любая компания по научным снабжениям	Н/Д
Соли MS	Сигма-Олдрич	M5524
Ячейка с подсчётом Седжвика-рафтера	Hauser Scientific	HS3800
Камера с пресс-уплотнением инкубатина с пробным клипсом	Сигма-Олдрич	Z359483
Рифампицин	Сигма-Олдрич	R3501