Образование стрессовых гранул во время инфекции раковых эпителиальных клеток Shigella

Аннотация

Источник: Vonaesch, P. и др., Иммунофлуоресцентный анализ образования стресс-гранул после бактериального испытания клеток млекопитающих. J. Vis. Exp . (2017)

В этом видео демонстрируется заражение эпителиальных клеток патогенной бактерией Shigella flexneri и возникающий ответ клеток хозяина. Бактериальные эффекторные белки нарушают трансляцию хозяина, вызывая образование органелл без мембраны, называемых стресс-гранулами, которые отражают адаптивный ответ клетки на инфекцию.

Протокол

1. Подготовка бактерий и клеток хозяина

1. Стеклянные крышки диаметром 12 или 14 мм переносятся в пластины на 24 или 12 лунок соответственно, с помощью стерильных пинцетов, считая по одной яме в каждом экспериментальном состоянии. Стерилизуйте их ультрафиолетовой (УФ) обработкой в вытяжке для тканевых культур в течение 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Включать контрольные скважины для бактериального вызова и для индукции стресс-гранул (SG) экзогенными напряжениями.
2. Для пластины с 24 лунками и 12-мм покрытием семя 1 x 10⁵ клеток млекопитающих (например, HeLa) на покрытия; Прижмите крышку скользящей стерильной пипеткой. Оставьте клетки на ночь при 37 °C в инкубаторе для культуры тканей с содержанием 5%_CO2 в среде, подходящей для каждого типа клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пластинчатые клетки так, чтобы слияние клеток составляло от 40 до 60% на следующий день.
   1. Для клеток HeLa инкубировать в модифицированной среде Eagle (DMEM) Dulbecco с незаменимыми аминокислотами (NEAA) и 10% декомплементированной сывороткой плода телячьей мышцы (FCS). Декомплементировать FCS, нагревая 30 минут в водяной бане при температуре 56 °C, после чего через 15 минут прокрутите сыворотку один раз.
3. Чтобы вывести бактерии, используйте стерильный кончик пипетки, чтобы удалить небольшое количество из бактериального глицерила (20% глицерила), хранящегося в морозильнике при температуре -80 °C, и положите на разметированную тарелку. Используйте стерильную петлю, чтобы распределить бактерии примерно на 10% пластины. Используйте новую стерильную петлю и проведите её через размазок, чтобы сделать три параллельные линии длиной в полпластины. Пройдите по этим линиям, покрывая остальную часть тарелки. Инкубировать плиту O/N при 37 °C.
   1. Выберите одну бактериальную колонию (например, Shigella flexneri) из только что нанесенной пластины. Избегайте работы с бактериальными колониями старше 1 недели.
   2. Для штамма S. flexneri M90T инокулируйте красную колонию из свежеочищенного триптического соевого агара-0,1% конголезской красной агара в 8 мл бульона Триптического соевого бульона в трубке объёмом 15 мл; Затянуть крышку и инкубировать встряхивание при 222 об/мин O/N при 30 °C. ВНИМАНИЕ: Не используйте крупные белые колонии, так как они потеряли вирулентную плазмиду и не являются инфекционными.

2. Бактериальный вызов клеток хозяина

1. Подготовьте бактерии для максимального риска заражения.
   1. Для S. flexneri субкультивировать бактерии, добавляя культуру 150 мкл O/N к 8 мл триптического соевого агар и инкубировать встряхивание при 222 об/мин при 37 °C в позднюю экспоненциальную фазу (~2 часа), чтобы индуцировать экспрессию генов вирулентности и усилить инфекцию.
      1. При оптической плотности культуры от 0,6 до 0,9 (измеряется при 600 нм), перенесите 1 мл культуры в трубку объёмом 1,5 мл. Пеллетные бактерии в течение 2 минут при дозе 8 000 x г и восстанавливаются в инфекционной среде (DMEM с NEAA, без FCS) при_{OD 600} = 1. Таким образом, если_{OD 600} равен 0,85, повторно подвесьте в 850 мкл.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для S. flexneri при_{OD 600} = 1 при культивировании в среде 8 мл будет 8 x 10⁸ бактерий на мл. Уместна множинная инфицированность (MOI) 20. Для других патогенов необходимо эмпирически определить количество бактерий на мл при_{OD 600} и соответствующий MOI.
   2. Для усиления взаимодействия бактерий и хозяина покрывают бактерии поли-L-лизином (PLL).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение ПЛЛ S. flexneri не повлияло на динамику SG. Необходимо оценить другие патогены на их пригодность к лечению ПЛЛ.
      1. Для покрытия бактерий PLL, центрифугуйте 1 мл бактериальной культуры в течение 2 минут при 8 000 x g, а затем повторно суспензуйте гранулу в 10 мкг/мл PLL в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) при_{OD 600} = 1.
      2. Добавьте бактериальный раствор в небольшую чашу, например, в колодец внутри тарелки на 12 лунок, и инкубировать при RT (~ 20 °C) в течение 10 минут с аккуратным перемешиванием на шейкере для тарелки.
      3. Пеллетные бактерии в течение 2 минут при 8 000 г удалите лишние PLL. Повторно подвесьте гранулу в 1 мл PBS и повторите этот этап промывания дважды. После окончательной промывки снова взвешивают в инфекционной среде при_{OD 600} = 1.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае средой заражения для S. flexneri является среда хозяина с содержанием 20 мМ N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновая кислота) (HEPES) без ФКС.
2. Подготовьте клетки к бактериальному вызову.
   1. Удалите среду из клеток HeLa млекопитающих с помощью вакуумного насоса. Добавьте 500 мкл среды RT HeLa для промывки клеток, прокрутите, удалите среду с помощью всасывающего насоса и замените на 500 мкл среды комнатной температуры (RT) соответствующую инфекционную среду (например, среду для клетки-хозяина с 20 мМ HEPES без FCS).
   2. ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этапах мытья работайте быстро и обрабатывайте только до 4 накладок за раз, чтобы избежать пересыхания ячеек.
3. Challenge подготовил клетки HeLa с бактериями, чтобы заразить 20–50% клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо определить подходящее время и MOI для каждого вида бактерий. Обычно хороший старт — 30 минут при 37 °C с MOI 10.
   1. Для S. flexneri проверьте клетки HeLa одним из двух методов (шаг 2.3.1.1 или 2.3.1.2).
      1. Вращайте бактерии, не обработанные PLL, (20 мкл_{OD 600} = 1/скважина 24-лунной пластины в среде 500 мкл) на клетки в течение 10 минут при 13000 x г.
      2. Добавьте бактерии с покрытием PLL (15 мкл_{OD 600} = 1/скважина пластины с 24 лунками в среде с объёмом 500 мкл) на 15 минут при RT, чтобы бактерии могли оседать на клетках.
   2. Позвольте инфекции произойти, поместив клетки с оседшими бактериями в инкубатор для культуры тканей при температуре 37 °C на 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для коротких временных точек синхронизируйте инфекцию S. flexneri , помещая пластины в водяную баню при температуре 37 °C на 15 минут вместо инкубатора для культуры тканей.
4. Остановить заражение, промывая клетки.
   1. Чтобы промыть клетки и удалить избыточные бактерии, удалите среду с помощью вакуумного насоса, добавьте 1 мл свежей предварительно подогретой (37 °C) культурной среды HeLa (DMEM, 10% FCS, NEAA). Перемешайте среду, снимите и замените свежим материалом. Повторите дважды и оставьте свежую среду на ячейках.
      1. Для S. flexneri или других внутриклеточных бактерий после заражения клеток HeLa и промываний заменят среду стандартной тканевой культурной средой с содержанием гентамицина 50 мкг/мл, чтобы уничтожить внеклеточные бактерии и предотвратить дальнейшее вторжение клеток.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте антибиотики в среду для внеклеточных бактерий.
5. Инкубировать бактерии с клетками в течение нужного времени в инкубаторе для культуры тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: У S. flexneri инфекция может длиться до 6 часов, в зависимости от типа клетки. Для клеток HeLa дайте инфекции продолжаться 1,5–2 часа, прежде чем добавить экзогенные стрессы для стимуляции образования SG. Для инфекций Caco-2, при которых шигелла распространяется из клетки к клетке, инфицируйте в течение 30 минут — 6 часов, прежде чем добавить экзогенный стресс. Клетки могут быть фиксированы на этом этапе без добавления экзогенных стрессов для оценки образования SG в результате бактериальной инфекции.

3. Фиксационный и иммунофлуоресцентный анализ образования гранул стресса

ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте контрольные и экспериментальные склеивания одновременно, чтобы избежать окрашивающих различий, которые могут повлиять на анализ изображений на следующих этапах. Контрольные образцы не содержат инфекции как с индуцирующей SG, так и без неё, а также инфицированные образцы с и без SG-индуцирующего лечения.

1. Полностью удалите среду с помощью всасывающего насоса и фиксируйте образцы, добавив 0,5 мл RT 4% параформальдегида (PFA) в PBS. Инкубировать 30 минут на RT.
   ВНИМАНИЕ: PFA вреден для обработчика и окружающей среды. Примите необходимые меры для защиты обработчика и утилизации химических отходов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы фиксируйте на 15 минут, а затем замените на предохлаждённый метанол при -20 °C на 10 минут, чтобы сохранить более цитоплазматическую локализацию маркеров SG.
2. Удалите PFA с помощью пипетки и утилизуйте жидкость в соответствующий контейнер для отходов. Промыйте покровный слой физиологическим раствором 1 мл трис-буфером (TBS: 25 мМ Tris, pH 7,3; 15 мМ хлорида натрия, NaCl). Инкубируйте каверслип в течение 2 минут, слегка встряхивая на шейкере во время стирки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Shigella flexneri			Доступно в различных лабораториях по запросу
Бульон из триптона казеина сои (TCS)	BD Biosciences	211825	Стандартная среда роста для шигеллы, применение — бактериальный рост
TCS агар	BD Biosciences	236950	Стандартный агар для выращивания для Shigella, применение — бактериальный рост
Конголезский красный	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Инструмент различения Shigella , потерявшей вирулентную плазмиду, применение — бактериальный рост
Поли-L-лизин (PLL)	Сигма-Олдрич	P1274	Полезно для покрытия бактерий для усиления инфекции, применения — инфекции
Гентамицин	Сигма-Олдрич	G1397	Селективное уничтожение внеклеточных, но не цитозольных бактерий, применение - инфекция
HEPES	Жизненные технологии	15630-056	pH-буфер полезен при инкубации клеток в RT, применение — культивирование клеток
Модифицированный средний Eagle (DMEM) от Dulbecco	Жизненные технологии	31885	Стандартная среда для культивирования клеток HeLa, применение — клеточная культура
Сыворотка для плода телята (FCS)	Biowest	S1810-100	5% добавка, используемая для среды культивирования клеток HeLa, применение — клеточная культура
Незаменительные аминокислоты (NEAA)	Жизненные технологии	11140	Разбавление 1:100, используемое для среды для культивирования клеток HeLa, применение — клеточная культура
Диметилсульфоксид (DMSO)	Сигма-Олдрич	D2650	Реагент для разбавления, применение — клеточная культура
Параформальдегид (PFA)	Сцены электронной микроскопии	15714	4% PFA используется для стандартной фиксации клеток, применение - фиксация
24-ячественная клеточная культивная пластина	Сигма-Олдрич	CLS3527	Стандартные пластины для культивирования тканей, применение — клеточная культура
Стеклянные накладки диаметром 12 мм	NeuVitro	1001/12	Поддержка культивирования клеток для иммунофлуоресцентных приложений, применение - поддержка клеток
Щипцы	Сигма-Олдрич	81381	Дешёвый и надёжный монтажный материал, который хорошо подходит для большинства флуорофоров, применение — монтаж