Флуоресцентная визуализация колонизации бактерий в ткани почек мышей

Аннотация

Источник: Бехера, Р. К. и др. Метод на основе флуоресценции для изучения регуляции бактериальных генов в инфицированных тканях. J. Vis. Exp .(2019)

В этом видео демонстрируется метод подготовки ткани почек инфицированных мышей, окрашивания ДНК и обнаружения экспрессии бактериальных генов с помощью двойных флуоресцентных репортёров. Красный цвет отмечает все бактерии, а зелёный — клетки, чувствительные к инфекции.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этическому обзору животных.

1. Сбор органов и обработка тканей
   1. Эвтаназия животных с помощью вдыхания_CO2 и вывиха шейки матки в качестве вторичного метода, а также проведение вскрытия.
   2. Извлеките почки (справа) и другие жизненно важные органы (сердце, печень, лёгкие, селезёнку) и перенесите в полипропиленовые трубки объемом 15 мл, содержащие 10% буферизованного формалина.
   3. Дайте органам закрепиться в темноте при комнатной температуре с лёгким встряхиванием или вращением не менее 24 часов, но не более 48 часов.
   4. Внедрить органы в прозрачную замораживающую среду и хранить ткани при -80 °C.
   5. С помощью криостата разрежьте ткань на срезы толщиной 10 мкм.
   6. Сушите секции на предварительно очищенном, заряженном стеклянном стекле в течение 20 минут в темноте. Нанесите плотную монтажную среду с морилкой 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и наносите покрытие для покрытия. Зафиксируйте стекли при комнатной температуре на ночь и перенесите до 4 °C для длительного хранения.
2. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и обработка изображений
   1. Проверьте установленные стекли для обнаружения поражений с помощью лазеров, подходящих для используемого флуоресцентного репортёра. В этом случае используются зелёные (GFP или зелёный флуоресцентный белок), красный (tdTomato) и синий (DAPI) флуоресцентные сигналы.
   2. Получите изображение с помощью соответствующей цели для визуализации отдельных клеток (например, обычно используются объективы 20x или 40x).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мыши C57Bl/6	Река Чарльз	NA
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	Zeiss	NA
Микротом криостата	Thermo Scientific	NA
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Гомогенизатор Precellys 24	Лаборатории Бертина	NA
Суб Xero прозрачная среда для замораживания тканей	Mercedes Medical	MER5000
Микроскопические слайды Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Vectashield Antifade Medium Mount с DAPI	Vector Laboratories	H-1500