Визуализация морфологических изменений у бактерий с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток

Аннотация

Источник: Brzozowski, R. S. и др. Микроскопия флуоресценции живых клеток для изучения локализации субклеточного белка и изменений морфологии клеток у бактерий. J. Vis. Exp . (2019)

В этом видео демонстрируется флуоресцентная микроскопия живых клеток для визуализации морфологических изменений бактерий в реальном времени. В нём изложены этапы визуализации, таймлапс-сбора и деконволюции для получения высококачественных изображений в реальном времени.

Протокол

1. Визуализация

1. В день эксперимента включите систему микроскопа. Запустите программное обеспечение для обработки изображений (см. Таблицу материалов), кликнув на соответствующую иконку на рабочем столе. Инициализируйте микроскоп, нажав кнопку «Инициализировать микроскоп » (кнопка с изображением микроскопа) в диалоговом окне запуска программы. Убедитесь, что объектив полностью опущен с помощью крупной настройки микроскопа перед инициализацией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После инициализации должны появиться три дополнительных диалоговых окна помимо меню «Пуск»: resolve3D, сбор данных и монитор фильтра.
2. Капли масля 1,517 (показатель преломления) на объектив погружения масла 100x, поставленный производителем (числовая диафрагма = 1,4, рабочее расстояние = 0,12 мм; см. таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выбрать подходящее погружное масло для температуры, при которой проводится визуализация.
3. Загрузите стеклянную чашу с образцом в металлический корпус (гроб) и аккуратно поместите её в зажим для сцены.
4. Используйте ручку грубой регулировки, чтобы поднять объектив, пока масло не коснётся стеклянного дна тарелки. Используйте окуляр и ручку тонкой регулировки, чтобы сфокусировать сэмпл. Когда ячейки в фокусе, переведите ручку с окуляра в режим камеры, переместив переключатель, расположенный на передней части корпуса микроскопа, влево влево.
5. Начните эксперимент с помощью программного обеспечения для визуализации. В окне resolve3D выберите иконку Design/Run experiment , изображённую колбой. Должно появиться новое диалоговое окно под названием design/run experiment.
   1. Задайте количество Z-стеков и толщину образца с помощью вкладки design , а затем разделяйте вкладку в диалоговом окне проектирования/запуска эксперимента .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов в разделе репрезентативных результатов использовались 17 Z-стеков с интервалом 200 нм для статичных изображений и четыре Z-стека с интервалом 200 нм для таймлапс-микроскопии.
   2. Чтобы измерить толщину ячеек в образце, вручную постепенно регулируйте Z-плоскость, используя стрелки вверх и вниз в диалоговом окне resolve3D . Отметьте места, где клетки выходят из фокуса, как верхний и нижний пределы для получения изображения. Импортируйте эту информацию перед запуском эксперимента.
   3. Чтобы минимизировать фототоксичность и фотоотбеливание во время таймлапс-визуализации, уменьшите количество Z-стеков и выберите среднюю плоскость ячеек для получения изображения.
6. Выберите подходящий набор фильтров для эксперимента с помощью вкладки дизайна и каналов в диалоговом окне проектирования/запуска эксперимента (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. Также выберите источник для сбора информации POL/DIC. Отрегулируйте процент пропускаемости (интенсивность света) и продолжительность экспозиции для отдельных каналов, выбранных до съёмки, выбрав соответствующие параметры в диалоговом окне resolve3D .
      ПРИМЕЧАНИЕ: В тестовом поле зрения, которое не рассматривается для эксперимента, проверьте эти настройки, чтобы определить, получают ли выбранные параметры значимые флуоресцентные данные без пропуска слабого сигнала или его перенасыщения. Затем импортируйте эти параметры для экспериментальной установки.
7. Откройте список точек, выбрав кнопку Points list в диалоговом окне resolve3D . Должен появиться новый диалоговый окон с заголовками в списке очков. Отметьте несколько полей обзора для эксперимента, найдя подходящие поля обзора с помощью элементов управления микроскопом и выбрав опцию «Отметить точку» в диалоговом окне списка точек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз, когда микроскоп фокусируется на точке в списке баллов, нужно выбирать точку замены. Это можно сделать, сфокусировав микроскоп на соответствующей точке списка и нажав кнопку замены . Важно не касаться аналоговой ручки грубой или мелкой регулировки при перефокусировке; Используйте только программное обеспечение для настройки фокуса.
8. Установите параметры таймлапса, сначала выбрав дизайн, а затем вкладку таймлапса в диалоговом окне проектирования/запуска эксперимента. Выберите галочку таймлапса. Введите соответствующие параметры таймлапса в виде таймлапс-изображений/общего времени.
9. Задайте очки для изображения из списка точек, сначала выбрав дизайн , а затем вкладку points в диалоговом окне проектирования/запуска эксперимента. Выберите опцию списка точек посещения и введите точки, которые будут показаны в текстовом поле, разделённом запятыми или дефисами, если это полная последовательность.
10. Перед началом эксперимента отредактируйте имена файлов и расположение с помощью вкладки «Запуск » в диалоговом окне проектирования/запуска. Местоположение файла можно изменить, нажав кнопку настроек , выбрав папку с данными, а затем выбрав соответствующую папку или создав новую. Измените имена файлов, введя новое имя файла в текстовое поле имени изображения.
11. Начните эксперимент, выбрав кнопку воспроизведения в диалоговом окне «Начало эксперимента ».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для таймлапса постоянно проверяйте фокус в каждом поле зрения в течение эксперимента с помощью настройки DIC (чтобы избежать ненужного фотоотбеливания), а также перефокусируйте и обновляйте информацию из списка точек, так как клетки со временем теряют фокус.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агарозе	Биореагенты Fisher	BP160-100	Оценка по молекулярной биологии — низкая EEO
FM4-64	Инвитроген	T3166	Микроскопия
Стеклянная чаша	MatTek	P35G-1.5-14-C	Микроскопия
Микроскоп	GE	DeltaVision Elite	Кастомизированная подставка для перевёрнутого микроскопа Olympus IX-71; Индивидуальная башня для освещения и модуль подсветкивающей лампы. Цели: PLAPON 60X (N.A. 1,42, WD 0,15 мм); OLY 100X OIL (N.A. 1,4, WD 0,12 мм); DIC Prism Nomarski для 100X Objective; Камера CoolSnap HQ2; SSI Assembly 7-цветная; Камера контроля окружающей среды — непрозрачная.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	Ингибитор FtsZ
SoftWorx	GE		Программное обеспечение для визуализации, поставляемое производителем