$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Инокуляция Listeria monocytogenes мышам посредством инъекции в хвостовую вену и оценка бактериальной нагрузки в печени, селезёнке и сердцу
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся работа с животными выполняется в соответствии с рекомендациями CDC по биобезопасности уровня 2. Мышей обычно заказывают за неделю вперёд и сажают в клетки по 5 животных в каждой клетке. Мышам дают акклиматизироваться к новой лабораторной среде в течение четырёх дней перед инъекцией. В этих экспериментах использовались 6-8 недельных самок Swiss-Webster, которых содержали по 5 в клетке в барьерной среде и кормили неограниченной диетой.
- Подготовьте по одной клетке мышей за раз, сняв крышку и контейнеры для еды и воды, и поставьте клетку под нагревающую лампу на пять минут. Этот процесс позволяет расширять хвостовые вены, что облегчает проведение инъекций.
- Удалите одно животное и поместите его в шлейку (или трубку с отрезанным концом), чтобы удержать животное во время инъекции.
- Очистите место инъекции спиртовой прокладкой и дайте спирту испариться. Это не только очищает участок, но и дополнительно расширяет хвостовую вену.
- С помощью шприца объемом 1 мл с иглой 27,5 калибра аккуратно вводите мыши 200 мкл нужного посева в хвостовую вену.
- Используйте марлю, чтобы остановить кровотечение, которое может возникнуть после инъекции, и поместите животное в новую клетку.
- Повторите этот процесс для оставшихся животных и сортов. Обязательно маркируйте каждую клетку животных с указанием сорта, который они получили.
- Проверяйте животных ежедневно, удаляя и жертвуя тех, кто кажется больным. Если у животных нет признаков болезни, дайте инфекции продолжаться в течение 72 часов, прежде чем пожертвовать всеми животными.
- В качестве жертвы используйте анестезию сCO2 из бутылочного источника, пока дыхание не прекратятся, затем шейный вих, чтобы убедиться, что животное мертво.
- После жертвоприношения переместите животных в контейнер для тканевых культур для вскрытия.
- Используя блок для вскрытия, приколите каждую ногу животного крупными иглами и распылите 70% этанола, пока оно не насытится.
- Разрежьте кожу на брюшной полости и грудной клетке с помощью Y-образного разреза, который идёт от вагинального отверстия к модиковидному отростку, затем поднимается до подмышни каждой руки.
- Оттяните кожу и уберите иглы с каждой ножки, чтобы удержать вскрытие открытым.
- Аккуратно разрежьте брюшину, обнажая кишечник, желудок, печень и селезёнку.
- Сначала перерезав печеночную вену и корональную связку в верхней части печени, начните удалять печень. Дополнительные связки, которые нужно удалять, находятся под печенью, соединяя её с первой частью тонкого кишечника, а также с мускулатурой спины.
- Поместите печень в 5 мл стерильного ddH20 в 50 мл соколовой трубки.
- Далее удалите селезёнку, изолируя её и аккуратно отрезая сосудистую и связки. Селезёнка удаляется легче, чем печень. Поместите селезёнку в отдельную трубку с 5 мл стерильной ddH20.
- Определите диафрагму и аккуратно разрежьте грудную клетку, чтобы визуализировать грудную клетку. Прорезать ксифовидный отросток и грудину до уровня шеи, чтобы открыть грудную клетку, обнажая сердце и лёгкие.
- С помощью щипцов аккуратно возьмите сердце за вершину и поднимите его так, чтобы аорта и легочные сосуды были напряжёны. Перережьте эти сосуды, чтобы освободить сердце.
- Поместите сердце в трубку Falcon объемом 50 мл, содержащую 5 мл стерильногоddH 20.
- Выбрасывают тушу мыши и повторяют этот процесс для каждого животного, используя чистые соколиные трубки с 5 мл стерильных ddH2 0 длякаждого удалённого органа.
- После того как все органы удалены, очистите рабочее место и вернитесь на стол.
- Подготовьте набор из 5 трубок для очистки и стерилизации гомогенизатора для каждого набора органов от пяти мышей (например , один набор из 5 трубок для 5 печени, 5 трубок для 5 селезёнок и 5 трубок для 5 сердец). Четыре из каждой трубки должны быть заполнены 30 мл стерильнойддH 20, а одна — 30 мл 90% EtOH.
- Используя TissueMaster (или эквивалентный гомогенизатор), окуньте гомогенизатор (во время работы) в трубки, подготовленные на шаге 1.21, следующим образом для очистки зонда:
- Трубка 1 (ddH 2O) 5 сек в трубке 2 (ddH2O) 5 сек в трубке 3 (EtOH) 5 сек в трубке 4 (ddH2O) 5 сек в трубке 5 (ddH2O)
- Гомогенизируйте одну печень с помощью гомогенизатора не менее 2 минут или пока не останутся видимые части органа. Используйте пинцет, чтобы удалить крупный мусор из зонда.
- Повторите описанный процесс очистки.
- Повторите процесс гомогенизации для других печеней, убедившись, что зонд промывается между каждой печенью, используя описанный процесс.
- После того как все печени полностью угомонизированы, убрать промывочные трубки (1-5) для печени.
- Повторите процесс унификации/очистки и селезёнки, и сердца, обязательно используя новый комплект промывальных трубок для каждой серии органов. Если в какой-то момент промывочные трубки становятся мутными, убрать их и заменить на новые, чтобы завершить серию.
- После того как все органы будут гомогенизированы, проведите последний цикл очистки гомогенизатора и хорошо высушите его для хранения.
- Поместите примерно 200 мкл каждого органа в отдельную яме пластины с 96 лунками.
- Проводите последовательные разбавления образцов органов, разбавляя 1:10 в серии до 1:10 000 (печень и селезёнка) или до 1:1 000 (сердце).
- Точечную пластину разведите на предварительно нагретый LB agar. Также удалите по 20 ul каждого неразбавлённого органа и пластины на отдельные пластины LB агаров, чтобы перечислить CFU из плохо колонизированных органов.
- Сбросьте трубки с гомогенизированными органами и обмотайте 96-ядренные пластины с серией разбавления парапленкой и поместите их в морозильную коробку при -80 °C.
- Дайте пятнам высохнуть. Этот процесс ускоряется установкой пластин в капот и снятием крышек.
- После того как пятна высохнут, поставьте тарелки в инкубатор при температуре 37 °C на ночь.
- На следующее утро подсчитайте количество колоний в каждом месте и используйте серию разбавления для расчёта общего количества бактерий на орган.