Микроскопическая визуализация бактериальных микропоражений в ткани сердца мышей

Аннотация

Источник: Браун, А. О. и др. Визуализация Streptococcus pneumoniae в сердечных микропоражениях и последующая ремоделирование сердца. J. Vis. Exp. (2015).

Это видео демонстрирует микроскопическую визуализацию бактериальных микропоражений в ткани сердца мышей. Сердце мыши, инфицированной Streptococcus pneumoniae , собирают, промываются и фиксируются перед обработкой для получения корональных сечений. Эти срезы окрашиваются гематоксилином и эозином и исследуются под микроскопом, чтобы визуализировать бактерии, обитающие внутри микропоражений.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этическому обзору животных.

1. Инфекция

1. Заведите мышей BALB/c обоих полов в возрасте от 10 до 12 недель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Streptococcus pneumoniae серотип 4 TIGR4 — это вирулентный клинический изолят, который был секвенирован.
2. Выращивать TIGR4 в бульоне Тодда-Хьюитта при 37 °C при 5%_CO2 до достижения оптической плотности (OD₎₆₂₀ 0,5 (что соответствует 1,0 x^{10 8} единиц формирования колоний [CFU]/мл). Пеллетируйте пневмококковую культуру центрифугированием в течение 10 минут при 3 500 x g и удалите супернатант с помощью вакуумной линии. Суспензировать и разбавить бактерии стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) до конечной концентрации 1,0 x 10⁴ CFU/мл.
3. Используя индукционную камеру, анестезиируйте мышей с 2,5% испарённым изофлураном в кислороде. Подтвердите состояние анестезии с помощью лёгкого щипка пальца с помощью тупого пинцета.
   1. Удерживая анестезиированную мышь за загривку и вертикально одной рукой, вводите каждой мыши внутрибрюшно (т.е. п.) 100 мкл суспензии S. pneumoniae с помощью шприца с иглой калибра 27-30 (соответствует испытательной дозе 1,0 x 10³ CFU). Положите мышь обратно в клетку. Мыши обычно просыпаются через 30-40 секунд после инъекции.
4. Дайте инфекции продолжаться как минимум 24 (ранние) или 30 (продвинутый) час.
   1. Усыпить мышей асфиксией_CO2 . Выполните вывих шейки матки, чтобы убедиться, что мышь умерла. Эвтаназия дополнительно подтверждается удалением сердца на шаге 1.6.
5. Продезинфицируйте хвост спиртовым мазком и отрежьте участок шириной 2-3 мм. Собрать 2 мкл крови и последовательно разбавить кровь в 10 раз в PBS, содержащем гепарин натрия 1 U/мл, пять раз. Последовательное разбавление пластины на триптической соевой агарной пластине и инкубация за ночь при 37 °C при 5%_CO2. На следующий день экстраполирует из колонии уровень бактериемии.
6. Обездвижите мышь в положении лежа на хирургической платформе. Распылите грудь 70% этанола и высушите его. Хирургическими ножницами и щипцами откройте грудную полость, удалите грудную клетку и перерезайте диафрагму, чтобы открыть сердце и лёгкие. С помощью ножниц перережьте кровеносные сосуды, соединённые с сердцем, и аккуратно вырежьте сердце, чтобы избежать синяков щипцем.
7. Промывайте сердце с помощью PBS, а затем поместите его в кассеты для сбора образцов тканей, чтобы при сечении тканей были получены корональные срезы. Для вложения парафина поместите кассеты в 10% буферизованный формалиновый раствор, а на следующий день отправьте на парафиновое вложение.
   1. В качестве альтернативы можно быстро заморозить с использованием соединения с оптимальной температурой резки (O.C.T.) внутри криомолда, помещённого на сухой лёд.

2. Визуализация сердечных поражений и пневмококков внутри поражений

1. Урезать срезы сердца, встроенные с парафином, так, чтобы в каждом срезе ткани были видны 4 камеры сердца. Вырезать слайды толщиной 5 мкм.
2. Депарафинизируйте и окрашивайте стекли гематоксилином и эозином (H&E) стандартными методами.
3. Просматривайте сердечные срезы с окрашенными H&E, используя световой микроскоп при низком (100X, 200X) и высоком (погружение в масло: 400X, 1000X) увеличениях. Охарактеризовать сердце на наличие микропоражений в миокарде. Здесь можно получить изображения H&E с помощью микроскопа Zeiss Axioskop 2, оснащённого числовым объективом Plan-NEOFLUAR с числовой апертурой 100X 1.3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На ранних стадиях сердечные поражения различаются по разному окрашению, а в некоторых случаях — по наличию иммунных клеток (моноцитов и гранулоцитов), которые, по-видимому, являются моноцитами. При запущенных поражениях, особенно тех, что наблюдаются через 30 часов, иммунные клетки отсутствуют, а на их месте наблюдаются крупные вакуолеподобные поражения. Важно отметить, что хотя приток иммунных клеток на ранних стадиях развития сердечных поражений может происходить, он, по-видимому, не является обязательным.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бульон Тодда-Хьюитта	Neogen	7161A
O.C.T (оптимальная температура резки) Compound	Tissue-Tek (Сакура Финетек)	4583
Микроскопические стекли для тканей	Polysciences, Inc	24216
Паралюбная ветеринарная мазь	Дехра	12920060
Набор для окрашивания гематоксилина и эозина	Неуточнённый		Стандарт