$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этическому обзору животных.
1. Инфекция
- Заведите мышей BALB/c обоих полов в возрасте от 10 до 12 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Streptococcus pneumoniae серотип 4 TIGR4 — это вирулентный клинический изолят, который был секвенирован. - Выращивать TIGR4 в бульоне Тодда-Хьюитта при 37 °C при 5%CO2 до достижения оптической плотности (OD)620 0,5 (что соответствует 1,0 x10 8 единиц формирования колоний [CFU]/мл). Пеллетируйте пневмококковую культуру центрифугированием в течение 10 минут при 3 500 x g и удалите супернатант с помощью вакуумной линии. Суспензировать и разбавить бактерии стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) до конечной концентрации 1,0 x 104 CFU/мл.
- Используя индукционную камеру, анестезиируйте мышей с 2,5% испарённым изофлураном в кислороде. Подтвердите состояние анестезии с помощью лёгкого щипка пальца с помощью тупого пинцета.
- Удерживая анестезиированную мышь за загривку и вертикально одной рукой, вводите каждой мыши внутрибрюшно (т.е. п.) 100 мкл суспензии S. pneumoniae с помощью шприца с иглой калибра 27-30 (соответствует испытательной дозе 1,0 x 103 CFU). Положите мышь обратно в клетку. Мыши обычно просыпаются через 30-40 секунд после инъекции.
- Дайте инфекции продолжаться как минимум 24 (ранние) или 30 (продвинутый) час.
- Усыпить мышей асфиксиейCO2 . Выполните вывих шейки матки, чтобы убедиться, что мышь умерла. Эвтаназия дополнительно подтверждается удалением сердца на шаге 1.6.
- Продезинфицируйте хвост спиртовым мазком и отрежьте участок шириной 2-3 мм. Собрать 2 мкл крови и последовательно разбавить кровь в 10 раз в PBS, содержащем гепарин натрия 1 U/мл, пять раз. Последовательное разбавление пластины на триптической соевой агарной пластине и инкубация за ночь при 37 °C при 5%CO2. На следующий день экстраполирует из колонии уровень бактериемии.
- Обездвижите мышь в положении лежа на хирургической платформе. Распылите грудь 70% этанола и высушите его. Хирургическими ножницами и щипцами откройте грудную полость, удалите грудную клетку и перерезайте диафрагму, чтобы открыть сердце и лёгкие. С помощью ножниц перережьте кровеносные сосуды, соединённые с сердцем, и аккуратно вырежьте сердце, чтобы избежать синяков щипцем.
- Промывайте сердце с помощью PBS, а затем поместите его в кассеты для сбора образцов тканей, чтобы при сечении тканей были получены корональные срезы. Для вложения парафина поместите кассеты в 10% буферизованный формалиновый раствор, а на следующий день отправьте на парафиновое вложение.
- В качестве альтернативы можно быстро заморозить с использованием соединения с оптимальной температурой резки (O.C.T.) внутри криомолда, помещённого на сухой лёд.
2. Визуализация сердечных поражений и пневмококков внутри поражений
- Урезать срезы сердца, встроенные с парафином, так, чтобы в каждом срезе ткани были видны 4 камеры сердца. Вырезать слайды толщиной 5 мкм.
- Депарафинизируйте и окрашивайте стекли гематоксилином и эозином (H&E) стандартными методами.
- Просматривайте сердечные срезы с окрашенными H&E, используя световой микроскоп при низком (100X, 200X) и высоком (погружение в масло: 400X, 1000X) увеличениях. Охарактеризовать сердце на наличие микропоражений в миокарде. Здесь можно получить изображения H&E с помощью микроскопа Zeiss Axioskop 2, оснащённого числовым объективом Plan-NEOFLUAR с числовой апертурой 100X 1.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: На ранних стадиях сердечные поражения различаются по разному окрашению, а в некоторых случаях — по наличию иммунных клеток (моноцитов и гранулоцитов), которые, по-видимому, являются моноцитами. При запущенных поражениях, особенно тех, что наблюдаются через 30 часов, иммунные клетки отсутствуют, а на их месте наблюдаются крупные вакуолеподобные поражения. Важно отметить, что хотя приток иммунных клеток на ранних стадиях развития сердечных поражений может происходить, он, по-видимому, не является обязательным.