$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этическому обзору животных.
1. Инфекция
- Заведите мышей BALB/C обоих полов в возрасте от 10 до 12 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Streptococcus pneumoniae серотип 4 TIGR4 — это вирулентный клинический изолят, который был секвенирован. - Выращивать TIGR4 в бульоне Тодда-Хьюитта при 37 °C при 5%CO2 , пока культура не достигнет оптической плотности при 620 нм (OD 620) 0,5 (что соответствует 1,0 × 10 единицамформирования колоний [CFU]/мл). Пеллетируйте пневмококковую культуру центрифугированием в течение 10 минут при 3500 × г и удалите супернатант с помощью вакуумной линии. Суспензировать и разбавить бактерии стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) до конечной концентрации 1,0 × 104 CFU/мл.
- Используя индукционную камеру, анестезиируйте мышей с 2,5% испарённым изофлураном в кислороде. Подтвердите состояние анестезии с помощью лёгкого щипка пальца с помощью тупого пинцета.
- Удерживая анестезированную мышь за загривку и стоя вертикально одной рукой, каждой мыши вводите внутрибрюшинно (т.е.) 100 мкл суспензии S. pneumoniae с помощью шприца с иглой калибра 27-30 (соответствует испытательной дозе 1,0 × 103 CFU). Положите мышь обратно в клетку. Мыши обычно просыпаются через 30-40 секунд после инъекции.
- Дайте инфекции продолжаться как минимум 24 (ранние) или 30 (продвинутый) час.
- Усыпить мышей с помощью удушения CO2. Выполните вывих шейки матки, чтобы убедиться, что мышь умерла. Эвтаназия дополнительно подтверждается удалением сердца на шаге 1.6.
- Продезинфицируйте хвост спиртовым мазком и отрежьте участок шириной 2-3 мм. Собрать 2 мкл крови и последовательно разбавить кровь в 10 раз в PBS, содержащем гепарин натрия 1 U/мл, пять раз. Последовательное разбавление пластин на триптической соевой агарной пластине и инкубация за ночь при 37 °C при 5% CO2. На следующий день экстраполирует из колонии уровень бактериемии.
- Обездвижите мышь в положении лежа на хирургической платформе. Распылите грудь 70% этанола и высушите его. Хирургическими ножницами и щипцами откройте грудную полость, удалите грудную клетку и перерезайте диафрагму, чтобы открыть сердце и лёгкие. С помощью ножниц перережьте кровеносные сосуды, соединённые с сердцем, и аккуратно вырежьте сердце, чтобы избежать синяков щипцем.
- Промывайте сердце с помощью PBS, а затем поместите его в кассеты для сбора образцов тканей, чтобы при сечении тканей были получены корональные срезы. Для вложения парафина поместите кассеты в 10% буферизованный формалиновый раствор, а на следующий день отправьте на парафиновое вложение.
- Или можно быстро заморозить с помощью оптимальной температуры резки (O.C.T.) Соединение внутри криомолда, помещённого на сухой лёд.
2. Визуализация сердечных поражений и пневмококков внутри поражений
- Урезать срезы сердца, встроенные с парафином, так, чтобы в каждом срезе ткани были видны 4 камеры сердца. Вырезать слайды толщиной 5 мкм.
- Депарафинизируйте и окрашивайте стекли гематоксилином и эозином (H&E) стандартными методами.
- Просматривайте сердечные срезы с окрашенными H&E, используя световой микроскоп при низком (100×, 200×) и высоком (масляное погружение: 400×, 1 000×) увеличениях. Охарактеризовать сердце на наличие микропоражений в миокарде. Здесь можно получить изображения H&E с помощью микроскопа Zeiss Axioskop 2 с объективом Plan-NEOFLUAR с числовой апертурой 100× 1,3.
ПРИМЕЧАНИЕ: На ранних стадиях сердечные поражения различаются по разному окрашению, а в некоторых случаях — по наличию иммунных клеток (моноцитов и гранулоцитов), которые, по-видимому, являются моноцитами. При запущенных поражениях, особенно тех, что наблюдаются через 30 часов, иммунные клетки отсутствуют, а на их месте наблюдаются крупные вакуолеподобные поражения. Важно отметить, что хотя приток иммунных клеток на ранних стадиях развития сердечных поражений может происходить, он, по-видимому, не является обязательным.
3. Иммунофлуоресцентная микроскопия пневмококков в микропоражениях
- Разрезать сердце в криомолдингах микротомом толщиной 5 мкм и разместить секции на положительно заряженные стеклянные стекла. Дайте замороженным сердечным срезам оттаять и высохнуть на воздухе. Фиксируйте срезы на 10 минут в формалине с нейтральным буфером 10% (pH 6,8-7,2 при 25 °C).
- Промывайте слайды (3×) в PBS на 5 минут, пермеабилизуйте 15 минут в Triton X-100 0,2% в PBS, затем снова стирайте в PBS.
- Блокируйте срез ткани на слайдах с 10% козьей сывороткой в PBS в течение 1 часа.
- Промывать слайды с помощью PBS, накрывать и инкубировать сердечные срезы с антисывороткой против серотипа 4 pneumococcus в PBS 1:1 000 с 10% козьей сывороткой в течение 2 часов при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для отрицательных тестов исследователям следует использовать наивный антисыворотка для кроликов - После мытья с помощью PBS накройте и инкубируйте секции 10% козьей сывороткой-PBS с козьим антителом Флуоресцеин Изотиоцианатом (FITC) в концентрации 1:2 000 в течение 30 минут при 37 °C.
- Следуя инструкции производителя, используйте DAPI (4',6- Диамидино-2-фенилиндол) в дозе 5 мг/мл для визуализации эукариотических ядер. Промывайте и крепите секции салфеток с помощью FluorSave.
- Получайте флуоресцентные изображения с помощью системы конфокального микроскопа как при низком, так и при высоком увеличении. Соответственно отрегулируйте числовую диафрагму для получения оптимальных результатов. Здесь можно получить флуоресцентные изображения с помощью конфокальной системы с цифровым апертурным объективом 60× 1,42.