Обнаружение пищевых патогенов на основе ПЦР по обогащённым образцам мух

Аннотация

Источник: Pava-Ripoll и др. Обнаружение пищевых бактериальных патогенов от отдельных грязных мух. J. Vis. Exp . (2015)

В этом видео демонстрируется метод на основе ПЦР, который усиливает целевой бактериальный ДНК из обогащённых образцов мух с помощью специфических для патогена таблеток, позволяя в реальном времени обнаруживать флуоресценцию и анализировать кривую плавления для подтверждения наличия пищевых патогенов у отдельных насекомых.

Протокол

1. Гидратировать ПЦР (полимеразная цепная реакция) — готовые таблетки

1. Выберите охлаждённый (4 °C) блок охлаждения ПЦР и поставьте на вставку стойку для ПЦР-трубок.
2. Поместите соответствующие ПЦР-пробирки с таблетками, готовыми к ПЦР (в комплекте с каждым набором) для целевого пищевого патогена в держатель, согласно стеллажному файлу.
3. С помощью инструмента для снятия аккуратно снимайте конденсаторы из ПЦР-пробирок. Сбросьте крышки и убедитесь, что в каждой трубке есть таблетка.
4. Перенесите 50 мкл (для сальмонеллы и кронобактеров) или 30 мкл (для L. monocytogenes) лизата в специфические ПЦР-пробирки. Используйте новые оптические конденсаторы и плотно закрепите их на ПЦР-трубках с помощью инструмента для закрывания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления лизата в таблетки, готовые к ПЦР, образцы должны оставаться охлаждёнными при 2–8 °C до загрузки в систему обнаружения на основе ПЦР. ПЦР-трубки можно центрифугировать при 2 500 x g в течение нескольких секунд, чтобы убедиться, что полный объём находится на дне трубки.
5. Загрузите ПЦР-лампы в циклер/прибор системы обнаружения ПЦР, открыв ящик с приборами.
6. Поставьте стойку с ПЦР-трубками в ямы ящика и проверьте, правильно ли они установлены.
7. Закройте ящик и запустите программу в соответствии с протоколом производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент на основе ПЦР имеет заранее заданные параметры циклирования для каждого пищевого патогена.
8. Проверьте, отображается ли в полосе статуса циклического цикла ПЦР синяя полоса, указывающая на запуск усилительной части программы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для стандартных ПЦР-тестов время обработки всей программы (усиление и обнаружение) занимает примерно 3–3,5 часа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инструмент каппинга	DuPont	D11677028
Инструмент декапирования	DuPont	D11134095
Стойка/держатель для ПЦР-ламп	DuPont	D12701663
Тонкий кончик, щипцы с прямым кончиком	BioQuip	4731	Простерилизуйте перед использованием. Несколько поставщиков.
Охлаждающий блок			Несколько поставщиков.
Центрифуга			Несколько поставщиков.