Быстрый анализ на основе изображений для скрининга поверхностно-индуцированной бактериальной вирулентности

Аннотация

Источник: Перинбам, К., и Сириапорн, А. Быстрый анализ вирулентности бактерий на основе изображения с использованием амёбы. J. Vis. Exp .(2018)

В этом видео демонстрируется быстрый метод оценки вирулентности бактерий, основанный на изображениях, путём инкубации амёб с поверхностно прикреплёнными или планктонными бактериями, применением агарозной прокладки кальцеина-ацетоксиметилэфира (кальцеин-AM) и визуализации флуоресценции для обнаружения повреждения клеток хозяина.

Протокол

1. Микроскопия — подготовка агарной подложки

1. Подготовьте агарные подушечки примерно за 30–1 час до того, как амёбы будут готовы к смешиванию с Pseudomonas aeruginosa.
2. Микроволновка 50 мл агара 1% (w/v) в буфере проявления (DB) в колбе объёмом 250 мл. Смешивайте каждые 20 секунд, пока не исчезнут комки агара.
3. Охладите расплавленный агар, поместив его в предварительно разогретую водяную баню при 55 °C на 15 минут.
4. Добавьте 15 мкл стандартного раствора кальцеина-AM к 15 мл расплавленного агара в конической трубке. Перемешайте, аккуратно перевернув трубку 4–5 раз, и сразу переходите к следующему этапу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг в полипропиленовой центрифуге объёмом 15 мл. Не используйте толстый стеклянный контейнер, так как это приведёт к быстрому затвердеванию агар.
5. Вылейте расплавленную агарную смесь поверх стеклянной пластины размером 12 см x 10 см и дайте агару затвердеть 10 минут при комнатной температуре. Разрежьте затвердевшую агара на меньшие участки размером 1,5 см x 1,5 см, положив стеклянную пластину на печатную сетку и вырезая по сетке металлической линейкой.
6. Держите гель увлажнённым в влажной коробке до готовности к использованию.

2. Микроскопия — подготовка образца бактерий-амёбы для визуализации

1. Для анализа вирулентности поверхностно прикреплённых бактериальных клеток добавьте 10 мкл амёбных клеток к поверхностно прикреплённым бактериям.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается смешивание амеб с бактериями.
2. Для анализа вирулентности планктонных клеток смешайте 10 мкл клеток амёбы с 10 мкл планктонных бактерий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не мойте выращенные аксенически выращенные клетки амёбы (при_{OD 600} от 0,2 до 0,5) перед смешиванием с бактериями. Рост E. coli в культуре амёбы не наблюдается из-за использования антибиотико-антимикотического раствора.
3. Немедленно положите агара размером 1,5 см x 1,5 см кальцеин-AM с шага 1,5 поверх смеси бактерий и амёбы на поверхность чашки Петри.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Положите агарную подушку поверх смеси быстрым и плавным движением. Не опускайте прокладку медленно на смесь, так как это движение склонно отталкивает клетки к периферии, прочь от нижней части подушечки. Этот этап обеспечит равномерное смешение бактерий и амеб, иммобилизацию и ограничение обоих типов клеток в одной плоскости.
4. Удалите лишнюю жидкость, аккуратно выведя оставшуюся жидкость вокруг агарной площадки. Дайте чашке Петри высохнуть 20 минут при комнатной температуре.
5. Накройте чашку Петри крышкой и инкубуйте обездвиженную смесь амебы и бактерий при комнатной температуре ещё 40 минут. Перейдём к шагу 3.1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно инкубировать все образцы одинаковое время, поскольку фоновая флуоресценция со временем увеличивается. Рекомендуется инкубационное время 1 час. Инкубации длительностью более 1 часа менее воспроизводимы, так как клетки амеб могут начать лопаться.

3. Микроскопия — получение изображений

1. Снимите амёб с помощью флуоресцентного микроскопа, способного получать яркие и зелёные флуоресцентные изображения. Для зелёной флуоресценции используйте фильтры зелёного флуоресцентного белка (GFP) с 474/27 нм и 525/45 нм соответственно для возбуждения и излучения. Используйте объектив 10X (≥0,3 числовой апертуры) для съёмки амеб.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кальцеин-AM в агаре вызывает флуоресцию умирающих амеб в зелёном флуоресцентном канале. Здоровые амёбы в остальном не флуоресцентны.
2. Скорректируйте время получения для фазового контраста и каналов GFP, чтобы ограничить фототоксичность и оптимизировать динамический диапазон интенсивности изображения. При необходимости заменить фазовый контраст дифференциального интерференционного контраста (DIC).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте экспозиции 100–200 мс для фазового контраста и, если возможно, флуоресценции GFP. Сохраняйте экспозицию и настройки приборов без изменений на протяжении всего эксперимента. Это критически важно для вычисления индекса уничтожения хозяина.
3. Получите изображения как минимум 100 клеток амёбы, чтобы получить хорошую статистику для расчёта индекса гибели хозяина.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагенты
Бакто агар, обезвоженный	BD Difco	214010
Антибиотик-антимикотик (100X)	Жизненные технологии	15240062	Аликвот < 1 мл и хранить при -20 °C
Кальцеин-ацетоксиметилэфир (кальцеин-AM)	Жизненные технологии	C34852	Кальцеин ацетоксиметил (AM)
Хлорид кальция, безводный	Сигма-Олдрич	C1016
D-глюкоза	Фишер Кемикал	D16500	Декстроза
Диметилсульфоксид	Сигма-Олдрич	D5879
Фолиевая кислота	Сигма-Олдрич	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Хлорид магния	Сигма-Олдрич	M8266
Экстракт дрожжей	Оксоид	LP0021
Специальный пептон	Оксоид	LP0072
Гирикс калия	Фишер Кемикал	P250
Монобазичный калийфосфат	Сигма-Олдрич	P0662
Дибазовый гептагидрат фосфата натрия	Фишер Кемикал	S373
Витамин B12	Сигма-Олдрич	V2876
Штаммы
Диктиостелий дискоидеум	Лаборатория Сиряпорн	Деформация AX318
Escherichia coli	Лаборатория Сиряпорн	Штамм B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Лаборатория Сиряпорн	PA14	Штамм PA1419
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Лаборатория Сиряпорн	AFS20.1	Strain20, полученный из PA14
Припасы
Фильтр 0,22 мкм	Миллипор	SCGPT01RE	Для стерилизации фильтров
Коническая трубка, 15 мл	Корнинг	352097
Стеклянные бутылки для хранения	Пирекс	13951L	250 мл, 500 мл, 1000 мл
Чашка Петри, диаметр 6 см	Корнинг	351007	Полистиролные пластины размером 60 x 15 мм
Чашка Петри, диаметр 10 см	Фишер	FB0875712	Полистиролные пластины размером 100 x 15 мм
Пластиковые контейнеры с крышкой	Ziploc	2.57E+09	Квадратные контейнеры по 3 чашки
Стеклянные пластины	Био-Рад	1653308	Для подготовки агарных подушек. Могут использоваться и другие стеклянные пластины с похожими размерами.
Деревянные палки	Фишер	23-400-102
Оборудование
Микроскоп Eclipse Ti-E	Nikon	MEA53100	Установка микроскопа
План 10X Fluor Ph1 цель 0.3 NA	Nikon	MRH20101	Установка микроскопа
Источник флуоресцентного возбуждения	Lumencor	Лёгкий двигатель Sola	Установка микроскопа
Набор флуоресцентных фильтров	Семрок	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Установка микроскопа
Камера Orca Flash 4.0 V2	Хамамацу	77054098	Установка микроскопа
ImageJ	NIH	ст. 1.49	Программное обеспечение для анализа изображений
MATLAB	Mathworks	R2013	Программное обеспечение для анализа изображений
Орбитальный шейкерный инкубатор	VWR	89032-092	Для роста бактерий при 37 °C
Шейкер платформы	Фишер	13-687-700	Для роста амеб при 22 °C
Спектрофотометр	Biochrom	Ultrospec 10
Охлаждаемый инкубатор с рефрижератором под стойкой	Фишер	97990E	Для роста амеб при 22 °C
Изотемпная водяная баня	Фишер	15-462-21Q	Для охлаждающих сред до 55 °C