Оценка бактериальной нагрузки в селезёнке мыши для исследований инфекций

Аннотация

Источник: Маденспахер, Дж. Х. и Фесслер, М. Б. Неинвазивный и технически неинтенсивный метод индукции и фенотипизации экспериментальной бактериальной пневмонии у мышей. J. Vis. Exp .(2016)

В этом видео демонстрируется процесс количественной оценки бактериальной нагрузки в селезёнке инфицированной мыши для оценки тяжести инфекции. Гомогенизированная селезёнка серийно разбавляется и покрывается для определения общего бактериального бремени. Полученные данные дают представление о взаимодействиях хозяина и патогена в системных тканях.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Мышиная внутритрахеальная аспирация Klebsiella pneumoniae из рохотки

1. Убедитесь, что мыши уникально идентифицированы по метке хвоста, татуировке или другому одобренному идентификатору.
2. Перед удалением мышей из изофлурана составьте дозировочный инокулям бактерий с помощью пипетки P200, чтобы ускорить процесс. Для наилучших результатов при ИТ-аспирации используйте объём <100 мкл, чтобы предотвратить переполнение. Здесь используйте 2000 единиц формирования колоний (CFU)/50 мкл K. pneumoniae.
3. Анестезируйте мышей в прозрачной камере с газом изофлурана (например, 2% изофлуран при расходе 1 л/мин) или согласно институциональным рекомендациям. Количество мышей для совместной анестезии определяется уровнем комфорта экспериментатора, обычно по 1-2 за раз. Наблюдайте за дыханием и подтверждайте уровень анестезии, когда глубокие вдохи станут видимы, и между вдохами можно отсчитать 2-3 секунды. ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть опасения по поводу возможных запутывающих эффектов летучих (ингаляционных) анестетиков, анестезия может быть получена внутрибрюшническим введением кетамина/ксилазина. При описанном выше методе глубокая анестезия длится всего несколько минут. Если будет введена более длительная анестезия, следует использовать глазную мазь для предотвращения высыхания глаз.
4. После анестезии мыши разместите её в полулежащем положении на спине, подвешенное на верхнечелюстных резцах на резинке, натянутой между колышками на наклонной плексигласовой доске (рисунок 1).
5. Аккуратно отведите язык мыши в сторону с помощью тупых щипцов без ребра и введите дозу в ротовую полость пипеткой P200. Будьте очень осторожны, чтобы избежать травмы языка или ротоглотки.
6. Держа язык втянутым, аккуратно закройте нос перчаткой, пока мышь не вдохнет. Продолжайте закрывать нос, пока мышь не сделает два или более вдыханий, и в полости рта не будет видна жидкость. Покрытие носа помогает мыши вдыхать бактерии в лёгкие, так как мыши являются обязательными дышащими носом.
7. Вынимите мышь с доски для вакцинации и вернитесь в клетку, положив мышь на спину, чтобы предотвратить заслону или мусор во время восстановления от наркоза.
8. После того как все мыши были введены в дозу и проснулись после анестезии, помещайте мышей в кабинку/комнату, содержащую только мышей, которые получили K. pneumoniae. Следите за мышами ежедневно, включая вес тела, если они проходят более 48 часов после заражения.
9. Используйте ежедневное затирание и/или дополнительное нагревание, если мыши могут работать более 48 часов.

2. Определение бактериальной нагрузки в легких и периферических тканях

1. Перед началом: подготовьте разбавляющие трубки с 900 мкл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для лёгких и селезёнки и 90 мкл 1x PBS для крови. Маркировка пластин для культивирования бактерий и установка при комнатной температуре; Поэтому после сбора ткани время между гомогенизацией и покрытием для роста бактерий будет минимально.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за гетерогенного отложения бактерий в лёгких, которое может возникать при аспирации, рекомендуется использовать отдельных мышей для анализа либо общей клеточности дыхательных путей, либо общей (двусторонней) бактериальной нагрузки легких.
2. Эвтаназия мышей согласно институциональным рекомендациям. В этом случае применяют смертельные инъекции пентобарбитала натрия 150 мг/кг или эквивалентную дозу коммерческого раствора для эвтаназии, после чего следуют эксксангинация, так как это предотвращает возможные осложнения лёгких, связанных с вдыханием_CO2 и вывихом шейки матки.
3. Удалите селезёнку и поместите её в 2 мл 1x PBS. Поставьте трубки на лёд. Следите за тем, чтобы очищать инструменты этанолом между салфетками или мышью.
4. Гомогенизуйте ткань на льду, желательно с помощью одноразовых гомогенизаторов, которые можно менять между каждым образцом. Одноразовые наконечники гомогенизатора могут быть автоклавированы для повторного использования между экспериментами.
5. После гомогенизации ткани проводите серийное разбавление и пластины. Образцы заданной ткани/разбавления в дублике на одной пластине триптического соевого агар (TSA) путём проведения разделительной линии на пластике. Ниже приведены предложения по нанесению и разбавления (во всех случаях 10 мкл образца распределяется на пластину) и основаны на 24-часовой некропсии после инфекции. При анализе образцов длительностью 48–72 часа может потребоваться покрытие большего количества разбавлений из-за увеличения бактериальной нагрузки в более поздние временные моменты
   1. Для селезёнки — разбавьте 1:10-1:100, добавив 100 мкл гомогенизированной селезёнки в 900 мкл стерильного 1x PBS последовательно. Пластина аккуратно гомогенированная, и оба разбавления в дубликате.
6. Дайте образцам спреда ненадолго высохнуть.
7. Переверните пластины TSA и поместите в статический инкубатор при температуре 37 °C на ночь.
8. Определите количество колонизирующих бактерий, усредняя количество бактериальных колоний с обеих сторон пластины и по каждому разбавлению. Учтите начальное разбавление 5 мл для легких и 2 мл для селезёнки для определения общего количества ХФУ тканей.

Результаты

Рисунок 1: Процедура по аспирационной пневмонии у мышей. Учебные мыши располагаются головой вверх и спиной к доске (то есть полулежащим), подвешенными резцами на резинке, натянутой между двумя колышками, закреплёнными на плексигл...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ATCC	43816
Бектон Дикенсон	211825
Подготовлено внутри компании	н/д	Дистиллированная вода (5 л), NaCl (40 г), KCl (1 г), Na₂HPO₄ (5,75 г), KH₂PO₄ (1 г)