Визуализация метаболитов аминокислот в кишечных тканях инфицированных мышей

Аннотация

Источник: Спекер, Дж. Т . и др. Исследование микробной кооперации с помощью масс-спектрометрического анализа бактериальных колоний, выращиваемых на агаре и тканях во время инфекции. J. Vis. Exp .(2022)

В этом видео демонстрируется использование масс-спектрометрии с использованием матрикс-асистированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI) для визуализации распределения аминокислот в кишечных тканях у мышей, инфицированных Clostridioides difficile, как самостоятельно, так и в сочетании с Enterococcus feecalis. Процедура включает подготовку тканей, нанесение матриксы, лазерную ионизацию и обнаружение ионов аминокислот для создания пространственных ионов. Результаты показывают микробную кооперацию, поскольку E. faecalis изменяет среду кишечника, высвобождая орнитин и истощая аргинин, тем самым усиливая патогенез C. difficile .

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка и отправка неинфицированных контролевых и целевых тканей мышей, инфицированных C. difficile,
   1. Прививите мышей-мужчин C57BL/6 возрастом 4-8 недель антибиотиками (0,5 мг/мл цефооперазона или 0,5 мг/мл цефооперазона + 1 мг/мл ванкомицина) в питьевой воде ad libitum в течение 5 дней, после чего следует двухдневный период восстановления и последующая инфекция.
   2. Усыпить животных с помощью асфиксии_CO2 и немедленно извлечь орган слепой груди мыши. Внедрить в смесь 20% соединения оптимальной температуры резки (OCT) в дистиллированную воду.
   3. Разместите образцы на сухом льду, затем упаковывайте и отправляйте для анализа; Храните при -80 °C до анализа.

 

2. Криосекция неинфицированной контрольной группы по сравнению с целовыми тканями мышей, инфицированных C. difficile.

1. Очистите всё криосекционное оборудование, промывая 100% этанолом, и дайте высохнуть перед тем, как помещать образцы в камеру криостата. Подготовьте микроскопические стекли с покрытием ITO, используя омметр для идентификации стороны стекла с проводящим покрытием. Используйте бриллиантовый наконечник для травления и маркировки покрытой ITO-стороной стекла микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует носить надлежащие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторные очки, лабораторный халат и рукава для криостата.
2. Проведите криосекцию исследовательского криомикротома. Переместить ткани мышиной цеки, встроенные в OCT, из морозильной камеры при температуре -80 °C в камеру криомикротома (температура камеры 30 °C, температура объекта -28 °C) на сухом льду. Смонтировать образцы тканей для сравнения с помощью масс-спектрометрии визуализации (например, неинфицированный контроль против C. difficile-инфицированных) на одном и том же микроскопском стекле, чтобы обеспечить одинаковую подготовку образцов обоих типов тканей и обеспечить точное сравнение метаболитов.
3. Внутри камеры криомикротома смонтировать ткань, встроенную в OCT, на образцовый патрон с использованием дополнительного раствора OCT. После того как раствор ОКТ затвердеет, крепите патрон на головке образца. Начинайте криосекцию с шагом 10-50 мкм, чтобы достичь нужной глубины/плоскости ткани органа.
4. Когда достигнуто оптимального поперечного сечения ткани, начинайте собирать срезы толщиной 12 мкм. Аккуратно обработайте кусок с помощью художественных кистей и поместите его на микроскопический слайд с тефлоновым покрытием.
5. Прокатите стекло микроскопа с покрытием ITO поверх тканевого участка, чтобы поднять ткань с тефлоновой капсулы. Оттаяйте тканевую секцию к стеклу микроскопа, прижимая ладонь к задней части жидкости, покрытой ITO. Продолжайте размораживать крепление, пока тканевый участок не станет полупрозрачным на непрозрачный/матовый.
6. Перенесите микроскопические стекли на сухом льду в сухую коробку с осушителем для хранения в тот же день, или храните при -80 °C для длительного хранения.

3. Подготовка неинфицированных контрольных тканей по сравнению с целевыми тканями мышей, инфицированных C. difficile, для матричного применения и масс-спектрометрии визуализации MALDI

1. Выполните применение матрицы MALDI (температура сопла 30 °C, восемь проходов, расход 0,1 мл/мин, схема CC, время сушки 0 с, 10 psi).
2. Проведите масс-спектрометрию MALDI
3. Анализируйте ионные изображения из нескольких биологических репликий и сравнивайте результаты на значимость с помощью сравнения с помощью квадратных графиков интенсивности с помощью статистического программного обеспечения SCiLS, упомянутого выше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие статистические тесты и сравнения зависят от применения и могут включать пространственную сегментацию, модели классификации и сравнительный анализ для определения дискриминационных и коррелированных спектральных признаков. Сравнительный анализ может включать присвоение p-значений значимым признакам, генерацию анализа основных компонентов для сравнения тканей и визуализацию квадратных графиков для выявления вариаций. Также полезно визуализировать ткань с помощью яркой микроскопии среза ткани, окрашенного гематоксилином и эозином (H&E) после масс-спектрометрии. Это позволяет четко определить морфологические особенности ткани и может быть проанализировано в консультации с квалифицированным патологом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,2 мкм нейлоновые шприцовые фильтры Titan3	Thermo Scientific	42225-NN
1,5-диаминонафалинов MALDI матрица	Сигма Олдрич	2243-62-1
20 мл шприцы Henke Ject luer lock	Хенке Сасс Вольф	4200.000V0
Конвекционный вакуумометр серии 275i	Компания Курта Дж. Лескера	KJL275807LL
7T solariX FTICR масс-спектрометр, оснащённый лазерной системой Smartbeam II Nd:YAG MALDI (2 кГц, 355 нм)	Bruker Daltonics
Раствор уксусной кислоты, подходящий для HPLC	Сигма Олдрич	64-19-7
Ацетонитрил, подходящий для ВЭЖХ, градиентный класс, ≥99,9%	Сигма Олдрич	75-05-8
Раствор гидроксида аммония, 28% NH3 в H2O, ≥99,99% из следовых металлов	Сигма Олдрич	1336-21-6
Автоклавируемые биоопасные мешки: 55 галлонов	Грейнджер	45TV10
Мешки для переноса образцов биологических опасностей (8 x 8 дюймов)	Fisher Scientific	01-800-07
Бульон для инфузии мозгового сердца	BD Biosciences	90003-040
C57BL/6 самцов мышей	Лаборатории Джексона
Фото- и сканер документов CanoScan 9000F Mark II	Канон
Исследовательский криомикротом CM 3050S	Leica Biosystems
Осушительный корпус	Сигма Олдрич	Z268135
Алмазный наконечник, Electronic Microscopy Sciences	Fisher Scientific	50-254-51
Дриеритовые осушительные гранулы	Дриерит	21005
Этанол, 200 доказательств	Decon Labs	2701
Программное обеспечение flexImaging	Bruker Daltonics
Программное обеспечение ftmsControl	Bruker Daltonics
Стеклянная вакуумная ловушка	Сигма Олдрич	Z549460
Роботизированный распылитель HTX M5 TM	HTX Technologies
Микроскопические стекли с покрытием оксида индия (ITO)	Delta Technologies	CG-81IN-S115
Линейный HEPA-фильтр для вакуумного насоса	LABCONCO	7386500
Метанол, HPLC класса	Фишер Кемикал	67-56-1
MTP слайд-адаптер II	Bruker Daltonics	235380
Оптимальная температура резки (OCT)	Fischer Scientific	23-730-571
Peridox RTU — спорицид, дезинфицирующее средство и очиститель	CONTEC	CR85335
Печатные слайды на PTFE (тефлон), Electronic Microscopy Sciences	VWR	100488-874
Вакуумный насос с роторным лопаткой RV8	Эдвардс	A65401903
Одноразовые микротомные лезвия Tissue-Tek Accu-Edge	Науки об электронной микроскопии	63068 л.с.
Прозрачная вакуумная трубка	Коул Палмер	EW-06414-30
Масло вакуумного насоса Ultragrade 19	Эдвардс	H11025011
Трансформатор с переменным напряжением	Powerstat
Вода, подходящая для HPLC	Сигма Олдрич	7732-18-5
Фляга дьюара с широким горлом	Сигма Олдрич	Z120790