$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Оценка влияния ингибиторов малых молекул на формирование колоний пелликул и биопленок
- Приготовьте двухкратный раствор определённой биопленочно-индуцирующей среды MSgg (мононатрий глутамат-глицерин) без гексагидра хлорида кальция и хлорида железа(III). После стерилизации фильтром добавьте хлорид кальция. Средство готово к непосредственному использованию или может хранить при температуре 4 °C в темноте.
- Приготовьте разбавление MSgg 1x в день эксперимента.
- Разведите среду 2x MSgg до 1x стерильной дистиллированной водой (пелликулами) или стерильной 3% горячей (80 °C) агаром (биопленки) и добавьте гексагидрат хлорида железа (III) к конечной концентрации 50 мкм (пелликулы) или 250 мкм (биопленки). Добавьте антибиотики или ингибиторы мелких молекул в нужной концентрации и хорошо перемешайте. Например, чтобы получить конечную концентрацию 0,5 мМ D-лейцина в 30 мл для образования пелликулов или биопленок, добавьте 196,6 мл раствора D-лейцина объемом 76,3 мм (10 мг/мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Итоговая композиция 1x MSgg описана в Таблице 1. По сравнению с исходным рецептом, среда содержала 50 мкг/мл треонина, а концентрация железа для выращивания колоний биопленки на твёрдой среде MSgg была увеличена в 2,5 раза для оптимизации морфологии морщинистой колонии.
- После затвердевания агара сушите твёрдые пластины MSgg в биологическом капюшоне в течение 30-45 минут перед инокуляцией.
- Для выбора специфических ингибиторов, мешающих механизмам формирования пелликулов (рисунок 1), исключите возможность того, что используемые концентрации влияют на планктонный и статический рост.
- Определите рост планктона (увеличение оптической плотности со временем в жидкой культуре) по простой кривой роста, измеряя оптическую плотность на 600 нм каждый час до фазы стационарного роста.
- Чтобы подтвердить, что измеренная мутность культуры соответствует количеству живых клеток, определите количество колониообразующих единиц (CFU) клеток в планктонной фазе роста из встряхивающей культуры в нескольких временных точках.
- Для оценки влияния ингибиторов малых молекул на рост статических пелликулов в конце трёхдневной инкубации при 23 °C из клетки с 24 лунками, инокуляцией при тех же условиях, как описано в разделах 1.7–1.9, и определите CFU. Для этого контроля используйте штамм с дефицитом пелликул, не имеющий оперонов, кодирующей компоненты внеклеточного матрикса (например, B. subtilis ΔepsH, ΔtasA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот штамм способен расти в статических условиях, но в отличие от дикого типа, образующего пелликулу, у него недостаток способности плавать к границе жидко-воздух, где рост благоприятн благодаря повышенному содержанию кислорода. Таким образом, этот штамм с дефицитом внеклеточного матрикса и пелликулы является рекомендованным эталонным штаммом для оценки роста в статических условиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для конкретного примера неканонической D-аминокислоты D-лейцина, описанного ниже, был исключён эффект на планктонный и статический рост при концентрациях, мешающих образованию пелликул. Методы определения планктонного и статического роста описаны подробно.
- Выделить B. subtilis из запаса при температуре -80 °C (культура LB из 109 клеток/мл, замороженная в 20% глицероле), чтобы изолировать отдельные колонии на пластине ЛБ-1,5% агара, используя стерильный наконечник или палочку-аппликатор.
- Расти ночью при 30 °C.
- КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Для устойчивого ингибирования пелликул неканоническими D-аминокислотами, такими как D-лейцин, выращивайте одну колонию, собранную из пластины ЛБ-1,5%, в бульоне объемом 3 мл при 37 °C в течение 4 часов в трясущем инкубаторе (скорость встряхивания 200 об/мин). Перед инокуляцией замените бульон LB на биоплёнкующую среду MSgg, центрифугая стартовую культуру объёмом 1,5 мл в течение 4 минут при 6000 x g, аккуратно удаляя супернатант и возвращая гранулу в среду MSgg объемом 1,5 мл. Остальную культуру можно отбросить. Важно: для обеспечения прочности системы оптическая плотность при 600 нм (OD 600) промытой стартерной культуры должна составлять от 0,6 до 1.
- Во время роста стартерной культуры приготовьте многокомпонентную пластину с 12-луночной клеточной культурой, содержащую 3 мл среды MSgg без или в концентрационном диапазоне ингибитора малых молекул (например, 0,3, 0,5, 1 мМ D-лейцина). Чтобы исключить эффекты краёв, распределите расположение разных концентраций по многотарелке. В качестве альтернативы используйте 24-колодочные многопластиночные пластины с 1,5 мл среды MSgg.
- Инокулизируйте колодцы многократной тарелки с 12 клетками 3 мкл промытой закваской культуры (разбавление 1:1 000).
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать более низкий коэффициент разбавления, то есть 1:500. Это сокращает время развития пелликул. - Выращивайте пелликулы при 23 °C в статических условиях в течение трёх дней. Не двигайте пелликулы в это время, так как это может повлиять на морфологию конечной поверхности пеликулы.
- Сделайте снимки с помощью бинокля и однородного освещения молний. Или сфотографируйте пелликулы камерой высокого разрешения. Чтобы избежать артефактов, вызванных непостоянными углами освещения и теней, делайте снимки сверху с камерой, закреплённой на штативе, и используйте мягкий и крупный источник света под углом 45° с обеих сторон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативным методом изучения многоклеточной многоклеточности B. subtilis является анализ колонии биопленки на твёрдой биопленочной среде MSgg. Как и пелликулы, этот анализ позволяет изучать пространственно-временные процессы. После определения активного диапазона ингибиторов малых молекул можно изучать их влияние на формирование колоний в биопленке. - Для выращивания колоний биопленки симметрично разместите 1,5 мкл немытой предварительной культуры (шаг 1,7) на высушенной 1,5% агаровой пластине MSgg с помощью шаблона — 4 капли на чашку Петри диаметром 8,5 см. Дайте каплям впитаться в тарелку, прежде чем двигать их.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблон помогает равномерно распределить колонии биопленки в зоне, где выращиваются клетки. Для подготовки шаблона нарисуйте общую площадь роста на исходных масштабах, разделите её на равные сектора и отметьте центр. Для круглой чашки Петри диаметром 8,5 см это присваивает 14 см2 на одну колонию биопленки. - Инкубировать тарелки при 30 °C в течение трёх дней. В это время колонии биопленки развиваются и образуют трёхмерную, морщинистую структуру.
- Делайте фотографии, как в шаге 1.11.
Таблица 1. Итоговая композиция MSgg, использованная в этом исследовании.
| 1,925 мМ | Монобазичный калийфосфат |
| 3,075 мМ | Калийфосфат дибазичный |
| 100 мМ | 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота, pH 7,1 |
| 2 мМ | Гексагидрат хлорида магния |
| 700 мкм | Безводный хлорид кальция |
| 50 мкма | Гексагидрат хлорида железа(III) |
| 125 мкмb |
| 1 мкм | Безводный цинкхлорид |
| 2 мкм | Тиамин гидрохлорид |
| 50 мкг/мл | Триптофан |
| 50 мкг/мл | Фенилаланин |
| 50 мкг/мл | Треонин |
| 0,5% (v/v) | Глицерин безводный |
| 0,5% (ч/в) | Гидрат солевой солей L-глутаминовой кислоты |
| aдля пелликульного анализа; bдля биопленочного анализа |
