Анализ устойчивости на этанол для оценки целостности матрицы биопленки

Аннотация

Источник: Bucher, T. и др. Методологии изучения биопленок B. subtilis как модели характеристики ингибиторов маломолекулярных биопленок. J. Vis. Exp .(2016).

Это видео демонстрирует, как целостность матрицы биопленки влияет на устойчивость бактерий к этанолу, сравнивая колониообразующие единицы в необработанных и нарушений ингибиторами биопленок. Снижение CFU в образцах, обработанных ингибиторами, демонстрирует, что внеклеточный матрикс необходим для защиты клеток, встроенных в биопленку, от антимикробного стресса.

Протокол

1. Анализ устойчивости к этанолу

1. Выращивайте биопленки и после 68 часов роста при 30 °C разрежьте колонии биопленки на две равные части с помощью лезвия бритвы и шаблона.
2. Аккуратно поднимите каждую половину колонии биопленки с агарной пластины небольшой лопаткой и переместите её в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл с 500 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). При необходимости соскребите оставшиеся клетки из пластины и перенесите их также в микроцентрифугную трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вторая половина колонии биопленки обрабатывается по-разному, в зависимости от того, является ли она контролем или для проверки устойчивости к стерилизующим средствам.
3. Для контроля инкубировать вторую половину колонии биопленки в 500 мкл PBS. Для оценки устойчивости к стерилизующим агентам переведите вторую половину колонии биопленки на 500 мкл 50% (v/v) этанол.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Могут использоваться альтернативные стерилизующие агенты, такие как гипохлорит натрия. Для всех используемых стерилизующих агентов определите активную концентрацию и время инкубации в предварительном эксперименте.
4. Инкубировать биопленочные колонии в течение 10 минут на столе при комнатной температуре.
5. Центрифугуйте колонии биопленки на 5 минут при 18 000 г и аккуратно удалите супернатант пипеткой. Добавьте 300 мкл PBS.
6. Слегка соникуйте клетки (амплитуда 10%, импульс 5 секунд) с помощью микронаконечника соникатора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Энергия соникации должна быть достаточной для разделения заполнителей биопленки. Однако слишком жёсткая сонификация может привести к лизированию клеток. Заранее проверьте световой микроскопией, что используемая энергия соника не лизирует клетки и что все агрегаты растворяются.
7. Добавьте 700 мкл PBS к итоговому объёму 1 мл. Проведите серийное разбавление (до ^10-7) в PBS и распределите 100 мкл 3 разбавления на пластину ЛБ-1,5% агар, используя стерильные стеклянные шарики.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные разбавления для покрытия должны быть определены в предварительном эксперименте, так как это зависит от количества клеток в интересующей колонии биопленки и уровня выживаемости клеток в ответ на стерилизующий агент.
8. Инкубировать пластины ночью при 30 °C, подсчитать CFU и определить CFU/мл. На основе итогового CFU/ml каждой половины биопленочных колоний рассчитайте процент выживших.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении и анализе в соответствии с описанием две половины контрольной биопленки и необработанная и этанолированная половина необработанной биопленки должны дать различия в жизнеспособных клетках менее 10%, что подтверждает симметрию или устойчивость колонии соответственно. Альтернативно, результаты можно представить в общем CFU. Количество клеток в контрольной и необработанной биопленке колонии должно оставаться в том же порядке. В отличие от этанола, количество клеток в обработанной этанолом части колонии биопленки, обработанной малыми молекулами, ожидается, что снизится как минимум на два порядка, чтобы гарантировать повышенную чувствительность к стерилизующему агенту.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Лурия Брот, Леннокс	Difco	240230
Бакто Агар	Difco	214010
Монобазичный калийфосфат	Сигма, 136,09 г/моль	P0662-500G
Калийфосфат дибазичный	Fisher Scientific, 174,18 г/моль	BP363-1
3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота	Fisher Scientific, 209,27 г/моль	BP308-500
Гексагидрат хлорида магния	Merck, 203,30 г/моль	1.05833.0250
Безводный хлорид кальция	J.T. Baker, 110,98 г/моль	1311-01
Тетрагидрат марганцев(II) хлорида	Сигма, 197,91 г/моль	31422-250G-R
Гексагидрат хлорида железа(III)	Sigma, 270,30 г/мч)	F2877-500G
Безводный цинкхлорид	Acros Organics, 136,29 г/моль	424592500
Тиамин гидрохлорид	Сигма, 337,27 г/моль	T1270-100G
L-триптофан	Fisher Scientific, 204,1 г/моль	BP395-100
L-фенилаланин	Сигма, 165,19 г/моль	P5482-100G
L-треонин	Сигма, 119,12 г/моль	T8625-100G
Глицерин безводный	Bio-Lab Itd	712022300
Гидратируют соль мононатрия L-глутаминовой кислоты	Сигма, 169,11 г/моль	G1626-1KG
D-лейцин	Сигма, 169,11 г/моль	855448-10G
Этанол бесводный	Гадот	830000054
Лезвие бритвы	Эддисон	NA
Круглая целлюлозная фильтровая бумага	Whatman, 90 мм	1001-090
Глутаральдегид	EMS (Электронная микоскопия), 25% в воде	16220
Параформальдегид	Скорая помощь, 16% в воде	15710
Какодилат натрия	Merck, 214,05 г/моль	8.2067
Хлорид кальция 2-гидрат	Merck, 147,02 г/моль	1172113
Шейкер 37 °C	Нью-Брансуик Scientific Innowa42	NA
Центрифуга	Настольная центрифуга Eppendorf 5424	NA
Цифровой сонификатор, модель 250, используется с микронаконечником Double Step	Брэнсон	NA
Инкубатор 30 °C	Папка	NA
Инкубатор 23 °C	Папка	NA
Система фильтрации, 500 мл, полистирол	Корниг Инкорпорейтед	NA
Вращательный шейкер — Orbitron Rotatory II	Бёкель	NA