Подготовка бактериальных биопленочных колоний для морфологического анализа

Аннотация

Источник: Bucher, T. и др., Методологии изучения биопленок B. subtilis как модели характеристики ингибиторов биопленки малых молекул. J. Vis. Exp.(2016)

В этом видео демонстрируется подготовка зрелых колоний бактериальной биопленки для высокоразрешающей визуализации. Он охватывает этапы фиксации, обезвоживания, монтажа и нанесения металлического покрытия для сохранения и визуализации морфологии биопленки.

Протокол

Подготовка образцов биопленки для сканирующей электронной микроскопии

1. Выращивать колонии бактериальной биопленки.
2. Приготовьте свежую партию 2% (v/v) глутаральдегида, 3% (v/v) параформальдегидного раствора в 100 мМ натрия какодилата, 5 мМ хлорида кальция, pH 7,3. Приготовьте 5 мл фиксатора для каждой чашки Петри диаметром 8,5 см.
   ВНИМАНИЕ: Глутаральдегид и параформальдегид опасны. Обращайтесь с ними с помощью защитного оборудования внутри химического капюшона. Выбросьте растворы и загрязнённые материалы из опасных отходов.
3. Аккуратно добавляйте фиксатор в колонии биопленки, не разливая его непосредственно поверх биопленок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за гидрофобного характера колонии биопленки колонии постепенно отделяются от агара и начинают плавать на плаву.
4. Аккуратно запечатайте пластины полоской парапленки. Инкубировать на вращающем шейкере 2 часа при комнатной температуре, а затем перевести пластины на 4 °C на ночь.
5. На следующий день аккуратно удалите жидкость пипеткой Pasteur, подключённой к вакуумному насосу.
6. Аккуратно добавьте 10 мл 100 мл натрия какодилата и 5 мм хлорида кальция, чтобы промыть биопленку и инкубировать в течение 5 минут. Аккуратно уберите жидкость стеклянной пипеткой Pasteur из угла тарелки, чтобы не повредить биопленку, и добавьте свежий раствор для стирки с помощью аккуратной пипетки. Повторите этот шаг один раз.
7. Для обезвоживания колоний биопленки следует следующими этапами: 2x 5 мин в_{ddH 2}O; 2 раза по 20 минут с 30% этанолом; 2 раза по 20 минут с 50% этанолом; 2 раза по 20 минут с 70% этанолом; 2 раза по 20 минут с 96% этанолом; 2 раза по 30 минут с 100% этанолом.
   1. Добавляйте 15 мл жидкости на каждую чашку Петри диаметром 8,5 см на каждом этапе и аккуратно удаляйте жидкость после каждой инкубации.
8. Используйте один из двух разных способов сушки образцов этанола.
   1. Для сушки на воздухе от этанола:
      1. Нарежьте целлюлозную фильтрационную бумагу (диаметром 9 см) на четверти. Кратко погрузите четверть в 100% этанол, а затем аккуратно перенесите на неё одну плавающую колонию биопленки. Положите влажную фильтрующую бумагу в чашку Петри, выстланную фильтрующей бумагой. Накройте чашку Петри и дайте колониям биопленки высохнуть на ночь в химическом капюшоне.
9. Покройте заготовку электронной микроскопии углеродной лентой. С помощью пинцета аккуратно перенесите колонии биопленки на обрубку. Соедините каждую колонию с заглушкой, добавив тонкий мост из углеродной ленты, что крайне важно для устранения заряда под электронным пучком. На этом этапе обращайтесь с биопленками с осторожностью, так как они очень хрупкие. Храните образцы в осушителе не менее 24 часов или до осмотра.
10. В день исследования с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM) они наносят слой на колонии биопленки в течение 2 минут под углом 60° в золото-палладиевом распылительном оболочке. Повторите этот шаг дважды и поверните образцы на 120° между ними. В конце нанесите слой спуттером один раз в течение 3 минут сверху. Тонкий слой золотого палладия толщиной 20 нм улучшает проводимость и усиливает контраст образца для визуализации в сканирующей электронной микроскопии.
11. Храните образцы в осушителе, чтобы избежать регидратации до сканирующего электронного микроскопа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Глицерин безводный	Bio-Lab Itd	712022300
Этанол бесводный	Гадот	830000054
Лезвие бритвы	Эддисон	NA
Круглая целлюлозная фильтровая бумага	Whatman, 90 мм	1001-090
Глутаральдегид	EMS (Электронная микоскопия), 25% в воде	16220
Параформальдегид	Скорая помощь, 16% в воде	15710
Какодилат натрия	Merck, 214,05 г/моль	8.2067
Хлорид кальция 2-гидрат	Merck, 147,02 г/моль	1172113
Алюминиевое крепление с коротким алюминием	Скорая помощь, головка с слоем	75230
Углеродная клейкая лента	EMS	77825-12
Шейкер 37 °C	Нью-Брансуик Scientific Innowa42	NA
Инкубатор 30 °C	Папка	NA
Инкубатор 23 °C	Папка	NA
Вращательный шейкер — Orbitron Rotatory II	Бёкель	NA
S150 Sputter Coater	Эдвардс	NA
Экологический сканирующий электронный микроскоп	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA